植物生理学实验-氯化三苯基四氮唑(TTC)法测定根系活力.pptVIP

实验4  氯化三苯基四氮唑(TTC)法测定根系活力 实验目的 根系活力是衡量根系活动能力强弱的重要指标，可以衡量根系吸收水分或矿质元素的能力大小，甚至可以反映地上部分的营养状况以及产量水平。学会利用TTC法测定根系活力。 一、原理 生成的TTF比较稳定，不会被空气中的氧自动氧化，所以TTC被广泛地用作酶试验的氢受体，植物根所引起的TTC还原，可因加入琥珀酸、延胡索酸、苹果酸得到增强，而被丙二酸、碘乙酸所抑制。所以TTC还原量能表示脱氢酶活性，并作为根系活力的指标。 二、材料、设备仪器及试剂 （一）材料： 玉米等植物根系。 （二）仪器设备： 分光光度计； 天平； 恒温箱1台； 研钵1套； 漏斗； 量筒； 移液管；试管； 刻度试管10ml； 试管架； 药勺； 石英砂适量； 烧杯； 小培养皿；洗瓶。 二、材料、设备仪器及试剂 （三）试剂： 1. 乙酸乙酯 2. 次硫酸钠（Na2S2O4，强还原剂，俗称保险粉） 3. 1mg/ml的TTC溶液： 4. 磷酸缓冲液（66mmol/L，pH7）。 5. 1mol/L硫酸： 6. 0.4mol/L琥珀酸： 三、实验步骤 1．定性测定(教师做演示实验） （1）配置反应液 把1%TTC溶液，0.4moL/L琥珀酸钠和磷酸缓冲液按1︰5︰4比例混合。 （2）把根仔细洗净，把地上部分从茎基切除，将根放入三角瓶中，倒入反应液，以浸没根为度，置37℃左右暗处放1h，以观察着色情况，新根尖端几毫米以及细侧根都明显地变成红色，表明该处有脱氢酶存在。 三、实验步骤 2．定量测定 （1）TTC标准曲线的制作 取1mg/mL的T T C 2mL于100mL容量瓶中，加入2勺（黄豆大小）保险粉摇匀，加入乙酸乙酯40mL左右剧烈震荡至保险粉充分溶解，用乙酸乙酯定容至刻度，即成TTF标准液(20 μg /mL )。 按下表制作 T T F标准曲线。以空白作参比，在485nm波长下测定光密度，绘制标准曲线。 三、实验步骤 （2）.样品的提取及测定 样品提取：称取根样品0.5g，放入小培养皿，加入0.4%TTC溶液和磷酸缓冲液的等量混合液10ml，把根充分浸没在溶液内，在37℃下暗处保温1h，此后加入1mol/L硫酸2ml，以停止反应。（与此同时做一空白实验，先加硫酸，再加根样品，其他操作同上）。 根系活力测定：把根取出，吸干水分后与乙酸乙酯3～4ml和少量石英砂一起磨碎，以提出TTF。把红色提出液过滤后移入10ml刻度试管，用少量乙酸乙酯把残渣洗涤二至三次，皆移入试管，最后加乙酸乙酯使总量为10ml，用分光光度计在485nm下比色，以空白作参比读出光密度，查标准曲线，求出四氮唑还原量。 ?四、结果计算 四氮唑还原强度： mg/g(根鲜重)/h= 四氮唑还原量（mg）/ 根重（g）×时间(h) 五 注意事项 分光光度计的使用：看视频 保险粉的量要过量。 乙酸乙酯容易挥发，研磨时要求操作迅速。 T T F暴露空气中易被还原，标准曲线要求现配现用。 定性实验 * * 氯化三苯基四氮唑（TTC）溶于水中成为无色溶液，但还原后即生成红色而不溶于水的三苯基甲替（TTF），如下式： OD(485nm) 5 6 7 8 9 4 乙酸乙酯（ml) 5 4 3 2 1 0 TTF (ml ) 100 80 60 40 20 0 TTF含量(ug) 样品 空白 6 5 4 3 2 1 试管编号 ｝10 10 标准曲线制作 定量试验 *