实验八 总R等NA提取和反转录.pptVIP

* * 实验八 总RNA提取和反转录 实验目的： 1.掌握TRIZol试剂法提取细胞总RNA的原理和实验步骤； 2. 掌握反转录（RT）的基本原理和操作步骤。 总RNA提取 反转录 （RT） 聚合酶链式反应 （PCR） 检测目的基因的表达： 通过变性剂破碎细胞或者组织，然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA，样品分成水样层和有机层，RNA存在于水样层中。收集水样层后，通过异丙醇沉淀RNA，再经过洗涤、晾干、最后溶解等步骤即得到相对较纯的RNA。 反转录是在反转录酶的作用下，以总RNA中mRNA为模板合成cDNA的过程。 实验原理： 1．TRIzol试剂：主要成分是苯酚，它能裂解细胞，使细胞中的蛋白、核酸物质解聚并得到释放。此外，TRIzol中还有8-羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。 2．氯仿：与酚一起作用，使蛋白质变性；抽提水相中残留的酚，减少RNA损失。 3．异丙醇：沉淀核酸。 4．75℅乙醇（DEPC水配制）：去除RNA沉淀中的盐分。 试剂的用途： 实验步骤： 1. 取1/3小鼠完整肝组织（约1g），直接加入4mL TRIzol试剂。用匀浆器进行匀浆处理，室温放置5分钟,每组取0.5mL 。 2. 加入0.1mL氯仿，剧烈振荡15s，室温放置3min。 3. 10000rpm离心5min，RNA主要在上层水相中。转移0.3mL水相至新的离心管中。 4.加入0.5mL异丙醇，轻轻混匀，室温静置5 min。 5. 10000rpm离心5 min，弃上清。 6. 加入1mL 75℅乙醇，轻轻洗涤RNA沉淀，10000rpm离心5min，弃上清。 7. 室温晾干(约5～10min)。 8. 加入100μL无RNase水溶解RNA，取50μL用于A260和A280值测定。 9. 计算RNA的浓度和A260/A280值 总RNA提取 1只小鼠/小班，3个匀浆器/小班 （1）在0.2mL微量离心管中配制混合液 补水到 10 μL RNase free dH2O 1～5μg Total RNA 1 μL dNTP Mixture 1 μL Oligo dT Primer 使用量 试剂 （2）轻轻混匀，离心，将样品沉至管底后，65℃水浴保温5分钟，然后迅速冰浴冷却。 反转录（RT） 以下操作在冰上进行。 （3）往上述管中配制下列反转录反应液 5.5μL RNase free dH2O 1 μL PrimeScriptⅡRTase 0.5 μL (20 U) RNase Inhibitor 4 μL 5 × PrimeScriptⅡBuffer 10 μL 上述变性后反应液 使用量 试剂 （4）缓慢混匀，稍稍离心将样品沉至管底，按下列条件进行反转录反应： 42℃保温30～60分钟，70℃保温15分钟，然后冰上冷却。 1.提取总RNA和反转录的整个过程都要严格控制RNase的污染。操作者要配带口罩、帽子和手套。所有用到的塑料和玻璃器皿均需要灭活RNase。 2. 反转录中，迅速冰浴的操作一定要快，不能是温度缓慢下降，否则RNA可能局部复性降低反转录的效率。 3.反转录的反应中对RNA浓度有比较高的要求，因此必需测定RNA浓度。只有保证RNA浓度在合适的范围内才能提高扩增的成功几率。 注意事项: 28S 18S 5S,5.8S 1 2 （A） （B） (A)细胞总RNA的制备; (B)RT-PCR分析TBX5在不同细胞中的表达