实验二 马立克氏病三琼脂扩散实验.pptVIP

沉淀线的特征与位置： 1 抗原、抗体的特异性和浓度 2 抗原、抗体分子的大小 3 扩散率 * 实验二  马 立 克 氏 病琼 脂 扩 散 实 验 鸡马立克氏病是由 鸡马立克氏病病毒 （MDV）引起的鸡的一种 肿瘤性传染病。临床上以 消瘦、麻痹、皮肤和内脏 出现肿瘤为主要特征。可 造成严重的经济损失，是 世界养鸡业的主要疾 病之一。 鸡马立克氏病引起的劈叉姿势 流行病学 临床症状 病理组织学检查 病毒分离鉴定 血清学试验: ① 琼脂扩散实验(OIE推荐的替代试验方法) 马立克氏病诊断主要根据 ② 酶联免疫吸附实验 AGP可用于20日龄以上马立克氏病鸡羽髓抗原检测和1月龄以上鸡血清抗体检测。?? 目的要求 了解琼脂扩散试验进行疾病诊断的操作和结果判定方法 仪器与材料 器材：琼脂打孔器、微量移液器或带胶乳头滴管、平皿等。 试剂：马立克氏病标准抗原、标准阳性血清和标准阴性血清。 实验类型 单向单扩散、单向双扩散、双向单扩散、双向双扩散 实验目的要求、类型、仪器与材料 利用可溶性抗原和抗体在半固体凝胶中进行相向扩散反应，当抗原抗体分子相遇并达到适当比例时，就会互相结合、凝集，在两孔之间比例最合适的位置上出现白色沉淀带，从而判定相应的抗体和抗原。 可用于20日龄以上马立克氏病鸡羽髓抗原检测和1月龄以上鸡血清抗体检测。 实验原理 实验原理 琼脂糖的疏散网状结构有利于大分子的自由迁移； 合适比例的抗原抗体结合后聚集形成沉淀； 沉淀的产生阻止抗原抗体复合物的自由运动； 沉淀带一经形成，就像一道特异性的屏障一样，继续扩散而来的相同的抗原抗体，只能是沉淀带加浓加厚，而不能再向外扩散，但对其他抗原抗体系统则无屏障作用。 实验原理 a.如抗原抗体的浓度基本平衡时，此沉淀带的位置主要决定 于两者的扩散系数。 b.如果抗原过多，则沉淀带向抗体偏移，反之亦然。 实验原理 实验原理 抗原分子量抗体分子量 抗原分子量=抗体分子量 抗原分子量抗体分子量 c. 1%琼脂粉 0.01M PBS 封底 1／万硫柳汞 水浴加热融化 实验步骤 琼脂平板制备 鸡群马立克氏病感染情况的监测通常采用琼脂扩散试验， 检测对象包括：血清中马立克氏病病毒特异抗体或感染鸡羽髓 中马立克氏病病毒抗原。其操作方法如下： 1．琼脂糖平板制备 用0.01M pH7.4的PBS配制1％琼脂糖溶 液，水浴加温充分溶化后，加入培养皿，制成厚度约2～3mm厚 的琼脂糖凝胶板；置于室温下冷却凝固后，用7孔（梅花孔）打 孔器准确打孔，加热封底。 实验步骤 2．检测血清抗体时，中央孔内滴加马立克氏病病毒标准琼扩抗原，周边孔滴加待检血清，但至少一孔加阳性血清，抗原和血清的加入量以加满而不溢出为度。样品加毕后，将琼脂平皿加盖后平放于加盖的湿盒内，37℃温箱中孵育8～24h，观察并记录结果。测定抗体效价时可倍比稀释血清，以出现沉淀带的血清最大稀释度为抗体效价。 实验步骤 3．检测抗原时，中央孔加马立克氏病标准阳性血清，周边1、4孔加马立克氏病标准琼扩抗原，周边2、3、5、6孔加待检羽髓浸液，即在试管内加入1～2滴PBS然后将羽髓在其中挤压而成。加样后将琼脂平皿置湿盒内，于37℃温箱孵育，8～24h内观察结果。 实验步骤 1、切勿剧烈振荡融化后的琼脂糖，防止气泡的出现。 2、反应时间要适宜，时间过长，沉淀线可解离而导致假 阴性、不出现或不清楚。 3、加样时，注意不要产生气泡，以加满为度。 4、每加完不同的样后要更换枪头，以免造成污染。  注意事项 *