乙醇沉析分离可制得银耳多糖粗品再用CTAB溴化十六烷基三甲铵.PPTVIP

实训七、银耳多糖的制备及鉴定 目的要求 原理 材料用具 试剂 操作方法 1.银耳预处理 操作方法 操作方法 操作方法 操作方法 操作方法 操作方法 操作方法 操作方法 思考 题 * 黑龙江生物科技职业学院 生物制药技术 生物分离技术 主讲人：张爱华 实验原理 2 材料用具 3 操作方法 4 目的要求 2 1 5 5 注意事项 了解银耳多糖制备的基本原理 掌握糖类物质提取纯化的基本操作技术 银耳多糖主要成分为酸性杂多糖、中性杂多糖、 胞壁多糖、胞外多糖及酸性低聚糖五类， 不含核酸、蛋白质类物质。 可利用银耳子实体经水浸泡捣碎，酶浸提， 乙醇沉析分离可制得银耳多糖粗品， 再用CTAB (溴化十六烷基三甲铵)络合法 进一步精制得银耳多糖纯品并进行多糖的鉴定。 银耳子实体干品（50g左右） 烧杯 、布氏漏斗、抽滤瓶、分液漏斗、 量筒、离心机、恒温水浴锅、透析袋 、 滤纸、组织捣碎机、不锈钢锅。 （1）1％复合酶制剂(含果胶酶、纤维素酶和中性蛋白酶食品级复合酶)； （2）2％溴化十六烷基三甲铵（CTAB）配制： 取2 g CTAB溶于100 mL蒸馏水中，摇匀备用； （3）α-萘酚配制：α-萘酚5g溶于95％乙 （4） 5%三氯乙酸-正丁醇溶液； （5）2mol／L的氢氧化钠溶液； （6）0.5％甲苯胺乙醇溶液； （7）2mol／L氯化钠溶液； （8）2mol／L盐酸溶液； （9）活性炭；硅藻土。 （10）1％融菌酶制剂； （11）无水乙醇； （12）浓硫酸； （13）乙醚。 20 g 锈钢锅中 加水 1600 mL 20℃～25℃ 浸泡30min 捣碎机 中捣碎 银耳 浆液 2mol／L盐酸溶液调pH至6.3 加 入 1％ 复 合 酶 制 剂 50℃下 酶促反应 40min 银耳 浆液 2.酶浸提 80℃灭酶， 保温浸提 约1.5h 80℃ 水浴 浓缩 等体积5％三氯乙酸-正丁醇溶液 摇匀 离心 （3000r/min） 15 min 浓缩液 3.多糖的沉淀（有机酸除杂） 下层 清液 备用 吸去上层 正丁醇 中层 变性 蛋白 2mol／L的氢氧化钠溶液调pH至7 摇匀 抽滤 3.多糖的沉淀（脱色、透析 ） 下层 清液 备用 加1％活 性炭80℃ 加热 15 min 脱色 滤液扎袋 流水 透析12h 80℃水 浴浓缩 抽滤 加3倍量95％乙醇 摇匀 3.多糖的沉淀（乙醇沉析 ） 抽滤液 离心 （3000r/min） 15min 沉淀 用无水 乙醇洗 2次 乙醚 洗涤 1次 50℃ 以下 真空 干燥 4.精制（一） 取粗 品1 g 溶于100 mL水中 搅拌 静置 2h 2％ CTAB 滤液 离心 除不溶物 60℃ 解离 4 h 离心 3000r/min 15 min 80℃ 热水 洗 氯 化 钠 2mol／L 溶 液 100 mL 4.精制（二） 解离液 加 三 倍 量 95％ 乙 醇 透析液 80℃ 浓缩 离心 3000r/min 15 min 精品 银耳 多糖 离心 3000r/min 15 min 沉淀 用无水 乙醇、 乙醚 洗涤 上清液 流水 透析10h 50℃ 真空 干燥 5.多糖的鉴定（一） 观察硫酸层与糖溶液界面处颜色变化 透析液 1 mL α-萘酚溶液2滴 颜色变化 摇匀 沿管壁 缓加 入浓硫 酸 1.5 mL (勿振动) 5.多糖的鉴定（二） 透析 浓缩 透析 浓缩 2 mL 点于滤纸 0.5％甲苯胺乙醇溶液染色 加入2％CTAB溶液2～4滴 观察现象 注意事项 1.酶促反应的时间、温度应控制好。 2.在制备全流程中应时刻注意温度， 不能超过80℃ *