实验十就酵母核糖核酸的分离及组.pptVIP

实验十 酵母核糖核酸的提取及RNA的含量测定（苔黑酚法） 苔黑酚法测RNA的含量 1、标准曲线的绘制 混匀，沸水浴25—45min,冷却，测各管A670nm,以A670nm为纵坐标，RNA量（ug）为横坐标作图。 2、样品的测定 1.0ml样液+1.0ml蒸馏水+2.0ml苔黑酚试剂，混匀，沸水浴25—45min,测A670nm，根据标准曲线求得RNA的质量（ug）. * * 实验目的： 了解核酸的组分 掌握提取核酸和鉴定核酸组分的方法 掌握 苔黑酚法测定RNA含量的原理和方法。 实验原理： 酵母中RNA含量较多, 含量可达2.67～10.0%，DNA很少（0.03～0.516％），提取RNA以酵母最为理想。 RNA可溶于碱性溶液，研磨后离心去除沉淀（细胞碎片），当碱被中和后，上清液中加入乙醇可以使解聚的核糖核酸沉淀，离心弃上清液，可得到RNA的粗制品。 RNA versus DNA - Stability issues 一、核酸的水解 1. 碱水解 RNA的磷酯键易被碱水碱、DNA的磷酯键不易被碱水解。例如，在0.1 mol/L NaOH溶液中，RNA几乎可以完全水解，生成2′-或3′-磷酸核苷；DNA在同样条件下则不受影响。这种水解性能上的差别，与RNA核糖基上2′-OH的邻基参与作用有很大的关系。在RNA水解时，2′-OH首先进攻磷酸基，在断开磷酯键的同时形成环状磷酸二酯，再在碱的作用形成水解产物。 一、核酸的水解 2.酸水解 核酸分子中的糖苷键和磷酸二酯键在酸性条件下水解切断。其中糖苷键比磷酸二酯键更容易遭到水解。 核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在。 （1）核糖 糠醛 糠醛+甲基苯二酚（地衣酚、苔黑酚） 鲜绿色的复合物（ 670nm ） Fe3+ H+ （2）嘌呤碱+AgNO3 嘌呤碱的银化物 （3）（NH4)2MoO4+H2SO4 H2MoO4+(NH4)2SO4 H3PO4+ 12H2MoO4 H3P(Mo3O10)4+12H2O + 抗坏血酸 钼蓝 （660nm） 浓氨水 器材和试剂 器材：乳钵、150ml锥形瓶、水浴锅、量筒、吸管、滴管、试管及试管架、烧杯、离心机、漏斗 试剂： 0.2%氢氧化钠溶液、5%硝酸银溶液 冰醋酸、干酵母、 95%乙醇 、10%硫酸溶液、浓氨水 苔黑酚三氯化铁溶液 定磷试剂 （1）17%硫酸溶液 将17ml浓硫酸（比重1.84）缓缓加入到83ml水中。 （2）2.5%钼酸铵溶液 将2.5g钼酸铵溶于100ml水中。 （3）10%抗坏血酸溶液 10g抗坏血酸溶于100ml水中，贮棕色瓶保存。溶液呈淡黄色时可用，如呈深黄或棕色则失败，需纯化抗坏血酸。 临用时将上述3种溶液与水按如下比例混合。 17%硫酸溶液：2.5%钼酸铵溶液：10%抗坏血酸溶液：水=1:1:1:2(V/V) 操作 1、提取核糖核酸 5g酵母+30ml0.2%氢氧化钠 研磨均匀 锥形瓶，微波加热5分钟，冷却，离心（4000r/min）10分钟，取上清液，滴加冰醋酸使提取液呈酸性（pH5—6，石蕊试纸试之），加30ml95%乙醇溶液。注意要一边搅拌一边缓缓倾入。待核糖核酸沉淀完全，离心（3000r/min）3分钟，95%乙醇（每次约10ml）洗涤沉淀两次（即离心）。 2、组分鉴定 提取核酸+10%硫酸溶液5ml 10分钟 水解液 组分鉴定： 1）嘌呤碱:硝酸银溶液1ml +过量浓氨水,出现沉淀到沉淀消失，再滴加1ml水解液，观察有无嘌呤碱的银化合物沉淀。（注意先后顺序） 2）核糖 水解液0.5ml+苔黑酚三氯化铁溶液1ml，加热至沸1分钟，观察溶液颜色变化。 沸水浴 3）磷酸 水解液1ml+定磷试剂1ml 观察现象 实验结果： 水浴 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 苔黑酚试剂ml 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 蒸馏水ml 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0 RNA标准液ml 5 4 3 2 1 0