生化反应六工程实验课件.pptVIP

* 一．实验目的 1.掌握细胞反应动力学的研究方法； 2.巩固还原糖和生物量的测定原理与方法； 3.掌握酶反应速度的实验测定方法； 4.掌握最大反应速度rmax和米氏常数Km的测定方法。 二．实验原理 对细胞反应： 实验可得不同t的底物浓度Cs值和Cx值(细胞浓度)。 要求动力学参数KS，μmax；必求μ， ——测定时间区间△t内细胞浓度平均值。 碱性磷酸酶碱性条件下，催化磷酸单酯水解。根据酶催化反应机理： 可推导出米氏方程： 通过测定不同底物浓度CS下的反应速度r，可确定rmax和Km。 在510nm波长处比色测定OD值，从而计算出酶的活性（反应速度r）。 ONa │ O－P==O │ │ ONa OH │ + Na2HPO4 + H2O 碱性磷酸酶 一定pH、T 催化反应： 醌类化合物（红色） OH │ + AAP 铁氰化钾 OH－ 三．菌种、培养基、实验试剂和主要仪器 1．枯草芽孢杆菌AS1.398 2．Tris-培养基：葡萄糖0.4%；NaCl0.5%；（NH4）2SO41%；KCl0.1%；CaCl20.1mmol/L；MgCl21mmol/L；Na2HPO420μmol/L；酪蛋白水解物0.1%，溶于0.1mol/LTris-HCl缓冲液（pH7.4）中。分装于150ml三角瓶中，每瓶装50ml，于115℃，灭菌30min，冷却。（周二下午做) 3．0.1mol/LTris-HCl缓冲液（pH7.4）4．0.1mol/L pH8.8Tris-醋酸缓冲液 5．40mmol/L底物溶液 6．0.5mol/L氢氧化钠溶液 7．0.3%（W/V）4-氨基安替比林（AAP）溶液 8．0.5%（W/V）铁氰化钾溶液 9．3,5－二硝基水杨酸试剂(DNS试剂) 10．1mg/ml葡萄糖标准液 11. 甲苯 12．移液管，刻度试管，容量瓶，滤纸，三角瓶，布式漏斗，电子天平，恒温水浴槽，摇床，干燥箱，721分光光度计，灭菌锅，冰箱。 四．实验方法与步骤 1.种子液制备（以班为单位） 枯草杆菌在固体斜面培养基上活化后。接入8个装有50ml Tris-培养基的150ml三角瓶中，于30℃振荡培养18h作为种子液。（周三下午2:30做) 2.发酵液制备（以组为单位） 将上述培养好的种子液接入10个装有50mlTris-培养基的150ml三角瓶中，接种量5％（v：v），于37℃振荡培养0h、1h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h 、4.5 h、5 h 、5.5h(发酵到上述每一定时间取一瓶，测定发酵液的残糖含量和生物量，测定原理与方法见附录一，二)。 5 残糖mg/ml 生物量mg/ml 5.5 4.5 4 3.5 3 2.5 2 1 0 培养时间（hr） 表1 发酵动力学实验数据 3．枯草杆菌碱性磷酸酶酶液的制备 取种子液2瓶，分别加入甲苯（甲苯与种子液体积比1：20）（加一滴甲苯/1ml培养液），摇匀，37℃保温30min，制成酶液备用。 酶促反应动力学的研究 A510nm 充分混匀，放置10min 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 铁氰化钾溶液 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 0.3%AAP溶液 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 NaOH溶液 1.0 — 0.2 0.6 0.7 0.8 0.9 蒸馏水 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 pH8.8 Tris缓冲液 — 1.0 0.8 0.4 0.3 0.2 0.1 底物溶液 空白 60 50 40 30 20 10 试剂（ml） 反应前： 反应后： A510nm 充分混匀，放置10min 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 铁氰化钾溶液 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 0.3%AAP溶液 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 NaOH溶液 充分摇匀，37℃准确保温15min 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 酶液 37℃水浴保温5min — 0.2 0.6 0.7 0.8 0.9 蒸馏水 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 pH8.8 Tris缓冲液 1.0 0.8 0.4 0.3 0.2 0.1 底物溶液 6 5 4 3 2 1 试剂（ml） 酶活力（单位）=△OD510×1000=（OD510反应后－OD510反应前）×1000 r即为酶活力。 底物浓度对酶反应速度的影响——rmax和Km的测定 取13支试管，编号，按下表准确操作。以空白