细胞周期调控与检测.pptVIP

From: British J. Cancer 87:129-133 1:222-231 Mutation of G1/S regulators in human cancer 八、常用的细胞周期检测方法 流式细胞术 PI(碘化丙锭),可以与细胞内DNA和RNA结合,采用RNA抑制剂将RNA消化后,通过流式细胞术检测到的与DNA结合的PI的荧光强度直接反映了细胞内DNA含量的多少。 由于细胞周期各时相的DNA含量不同,因此,通过流式细胞术PI染色法对细胞内DNA含量进行检测时,可以将细胞周期各时相区分为G1/G0期,S期和G2/M期,并可通过特殊软件计算各时相的百分率: G1/G0期具有二倍体细胞的DNA含量(2N), G2/M期具有四倍体细胞的DNA含量(4N), S期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。 值得注意的是,PI不能通过细胞膜完整的细胞(如活细胞和早期凋亡细胞),在标本制备时,必须先用乙醇或其他破膜剂增强细胞膜的通透性,才能使PI进入细胞内与细胞内的核酸结合。乙醇通常为终浓度为70%的冷乙醇。 将肿瘤细胞以1×106接种于60mm培养板，80％汇合后传代。 24－72小时后用胰酶消化收集细胞，PBS洗两遍，弃上清，加入70％预冷乙醇中，吹打均匀，4℃固定12小时以上。 PBS洗涤去乙醇，1000rpm, 5min，洗两遍。 0.5 ml PBS重悬细胞，加入PI和 R