4t-a连接,走感受态细胞制备,转化及筛选.pptVIP

实验内容 1. PCR产物与T载体的连接 2.感受态细胞的制备， 连接产物的转化 实验一、PCR产物与T载体的连接 T vector 1 μl 10×ligation buffer 1 μl PCR回收产物 7 μl T4 DNA Ligase 1 μl 轻弹管底混合，离心机甩一下，置25oC水浴1~2h。 连接产物可以直接用于转化，也可以置-20oC保存备用。 （低温连接效果比室温好） 。 1. 连接反应 2. TA克隆原理 TagDNA 聚合酶的一个功能： 使PCR产物的3`端突出一个A。 3` A A 3` 5` 5` 3` T T 3` 5` 5` 商业设计的T载体：在3`端多出一个T。 两者的粘性末端可以互补配对。 应用时避免反复冻融，防止T的断裂丢失。如果与T载体连接后主要以自身环化为主，要考虑T可能已经丢失。 其他说明： 1）? 连接反应的关键是目的基因片段与载体的比例，一般片段与载体比例为2:1 或3:1（摩尔比），根据片段大小决定比例。 2）平端连接 平端连接通常需要先将载体的5?端磷酸去掉，然后再进行连接，这样