大豆中脲酶活性的测定.pptVIP

大豆饼粕中脲酶活性的测定 豆粕的蛋白质含量为45%左右，是一种优质的蛋白质饲料，但是由于其中的抗营养因子较多，极大的限制了豆粕在饲料中的应用。 大豆中的抗营养因子 胰蛋白酶抑制剂 植物红细胞凝集素 皂甙 胃肠胀气因子 植酸 抗维生素 致甲状腺肿因子 这些抗营养因子大多是不耐热的，在大豆饼粕的加工过程中由于加热而失活，从而降低或者失去其有害作用 ，因此，在大豆加工生产饲用饼粕时，必须对大豆粕进行充分而又适当的加热，这样才能使其中的抗营养因子失活 。 评价大豆饼粕的指标 脲酶活性： 检测豆粕的加热程度是否足以破坏其中的抗营养因子的指标。 蛋白质溶解度：反映豆粕是否加热过度的一个指标。 脲酶的测定方法 比色法 滴定法 PH增值法 快速检测法 PH增值法 1.实验原理： 脲酶水解尿素产生氨，使溶液的PH值升高，通过测定样品溶液的PH值和空白的PH值之差来计算尿酶活性。脲酶活性定义为：在30 摄氏度和PH为7的条件下，每分钟每克大豆制品分解尿素后，所释放的氨态氮的毫升数。 2.实验仪器与器皿 PH计，带玻璃的电极，甘汞电极，恒温水浴，50ml试管 3.试剂 磷酸缓冲液：称取3.403克磷酸二氢钾，溶于100ml的水中。再称取4.335克的磷酸氢二钾，溶于100ml的水中，合并两者并配制成1000ml，用酸或者碱调节PH=7。 尿素缓冲液：称取15克尿素，溶于500ml磷酸缓冲液中，调节PH=7 4.操作步骤 准确称取0.4克样品2份，分别置于2支试管中。一支试管加入20ml 的磷酸缓冲液，作为空白试验（A管），另一支加入20ml尿素缓冲液（B管）。盖塞混匀，在30℃恒温水浴中准确保持30min。在此期间，每隔5min摇匀一次。取出立即在流水中冷却，5min内测定溶液的PH值。 5.计算 溶液PH值与试剂空白PH值之差即为脲酶活性，公式如下： UA=B-A B——B管的PH值 A——A管的PH值 滴定法 a.原理：将粉碎的大豆制品与中性的尿酸缓冲液混合，在30℃保持30min，尿酸酶催化尿素产生氨，用过量的盐酸中和氨，再用氢氧化钠溶液回滴。酶的活性用1克分析材料在30℃下1min 产生氨态氮的毫克数表示。（mgN/g） b.仪器与器皿：样品筛，酸度计，恒温水浴锅，试管，10ml移液管 c.试剂：尿素 磷酸氢二钠 磷酸二氢钾 尿素缓冲液（PH6.9至7.0） 4.45克磷酸氢二钠和3.40克的磷酸二氢钾溶于水并稀释至1000ml，再将30克尿素溶于此缓冲液中。 盐酸 氢氧化钠 0.1mol/L标准溶液 操作方法 称取0.2克已粉碎的样品，转入试管中，加入10ml的尿素缓冲液，立即盖好试管并剧烈振动，马上置于30℃的恒温水浴中，准确计时保持30分钟。然后加入10ml0.1mol/L盐酸溶液，迅速冷却到20℃，将试管内容物全部转入烧杯，用5ml水冲洗试管2－3次，立即用标准氢氧化钾标准液滴定至PH=4.70。 另取试管作为空白管，加入10ml的尿素缓冲液，然后加入10ml0.1mol/L盐酸溶液。称取与上述试样量相当的试样，迅速加入此试管中，立即盖好试管并剧烈振动，马上置于30℃的恒温水浴中，准确计时保持30分钟，冷却到20℃，将试管内容物全部转入烧杯，用5ml水冲洗试管2－3次，立即用标准氢氧化钾标准液滴定至PH=4.70。 e.结果计算 UA＝14×C(V0-V)/(30×m) C——氢氧化钾标准溶液浓度，mol/L； V0——空白试验消耗氢氧化钾的体积， ml； V——测定试验消耗的氢氧化钾的体 积，ml； m——试验质量，g。 比色法 原理：向含有EDTA二钠盐的PH=7的缓冲液的分析悬浮液中加入尿素溶液，在30℃下保温5min，加入磷钨酸终止酶作用并沉淀蛋白质。产生的氨在次溴酸钠和麝香草酚作用下形成蓝色的靛麝香草酚，借以比色。 快速测定方法1 酚红法 称取0.2克的样品于试管中，加入0.2克的尿素，再加入2滴酚红指示剂及20ml蒸馏水，摇动10分钟，观察溶液的颜色。 1分钟内呈粉红色，脲酶活性很强； 1-5分钟呈粉红色，脲酶活性强； 5-15分钟呈粉红色，活性有点强； 15-30无色，没有活性。 通常10分钟以上不显粉红色的大豆饼粕其脲酶活性丧失。 快速测定方法2 在培养皿上放入少量的豆饼粕，在样品上滴入少量指示剂并搅拌，将其平铺于培养皿中，放置5min后观察结果。 无任何红点出现，再放置25min仍然无红点出现，说明豆粕过熟；