rna基本操发作技术.pptVIP

RNA基本操作技术 真核生物的基因组DNA非常庞大，而且含有大量的重复序列，无论用电泳分离技术还是用杂交方法度难以分离到靶基因片段。而cDNA则来自反转录的mRNA，不带有多余序列，通过特异性探针筛选cDNA文库，可以较快的分离到相关基因。 RNA基本操作技术 1.总DNA的提取 2.mRNA的纯化 3.cDNA的合成 4.cDNA文库的构建 5.基因文库的筛选 1.总RNA的提取 1.1 RNA的种类及特点 总RNA包括mRNA,rRNA,tRNA以及一些小RNA（sRNA）。一个典型的动物细胞中，80%-85%为rRNA 、15%-20%为tRNA及sRNA，mRNA约占总RNA的1%-5%。 rRNA电泳后的三条特征性条28S、18S和5S是鉴定总RNA纯度和完整性的重要参数。 mRNA呈单链状，易受核酸酶的攻击，操作时必须保证实验环境、所用器皿及溶液均无RNA酶的污染。 1.2总RNA的提取方法 1.2.1 Trizol法 原理： Trizol试剂使用最广泛的抽提RNA的专用试剂，主要由苯酚和异硫氰酸瓜组成可以迅速破坏细胞结构，使存在于细胞质及核内的RNA释放出来并使核糖体蛋白与RNA分离，还能保证RNA的完整性。 1.2总RNA的提取方法 提取步骤 1.用液氮研磨材料，匀浆加入Trizol试剂，进一步破碎细胞并溶解细胞成分。 2.加入氯仿抽提，离心，分离水相和无机相，收