03蛋白感质化学-3.pptVIP

蛋白质的研究方法 —— 蛋白质的分离、定性定量以及测序 蛋白质分离纯化的一般原则 每种细胞都含有成千上万种不同的蛋白质。为了研究蛋白质的结构与功能，需将其分离、纯化，尽量除去不需要的和变性的蛋白质。 所有的分离和纯化过程都必须在温和的条件下进行。 实质：①蛋白与非蛋白分开，②蛋白质之间分开 分离纯化蛋白质的程序 ①前处理 以适当方式将组织细胞破碎，使蛋白质以溶解状态释放出来，并保持其天然构象和原有生物活性。 动物组织：组织捣碎机、匀浆器和超声波破碎法； 植物组织：研磨或用纤维素酶处理； 微生物细胞：超声波法、高压挤压或溶菌酶处理。 前处理中的注意事项 组织破碎需加入适当缓冲液并在低温下进行，必要时加入蛋白酶抑制剂、巯基试剂等。对膜蛋白需加入去垢剂使膜结构瓦解，再用适当的介质提取。 若所要的蛋白质主要存在于某一细胞组分，如线粒体、叶绿体、细胞核等，可先用差速离心法将其分开，再以该细胞组分作为下一步分离提纯的材料。 差速离心法的步骤： ②粗分级 通常用盐析、等电点沉淀、超滤、有机溶剂分级等简便、处理量大的方法从蛋白质混合液中除去大量杂质，得到浓缩蛋白质溶液。 ③细分级 选用分辨率高的方法进一步提纯，如凝胶过滤、吸附层析、离子交换层析、反相高效液相层析、亲和层析以及凝胶电泳、等电聚焦等。 二、蛋白质分离纯化的方法 （一）根据分子大小不同的分离方法 1.透析和超过滤