SiRNA干扰介导CXCR4基因沉默在抑制恶性淋巴瘤转移中作用及机理.docVIP

SiRNA干扰介导CXCR4 沉默在抑制恶性 淋巴瘤转移中作用及机理 目的本研究拟通过RNA干扰技术抑制CXCR4基因 的表迗，并观察其对淋巴瘤细胞侵袭转移能力的影响。方法 设计合成CXCR4特异性小干扰RNA (siRNA)，并转染JURKAT 细胞。通过qPCR检测CXCR4mRNA的表达，用Transwell小 室体外细胞侵袭模型检测细胞体外侵袭能力。结果转染 PRNAT-U6. 2/Lenti-CXCR4_siRNA 的 JURKAT 细胞 CXCR4 基因 表达明显受抑制；与对照组比较，其细胞侵袭能力亦明显降 低。结论应用RNA干扰靶向沉默技术，高效特异性地抑制 淋巴瘤细胞CXCR4基因的表达，从而抑制肿瘤的侵袭能力。 关键词：恶性淋巴瘤；siRNA ； CXCR4 恶性淋巴瘤是一组原发于淋巴结和(或)结外部位淋巴 组织的淋巴细胞或组织细胞的恶性肿瘤。本研究拟通过RNA 干扰技术，靶向沉默CXCR4基因的表达，观察其对淋巴瘤侵 袭转移的影响。 1材料与方法 1. 1材料与试剂人淋巴瘤细胞株JURKAT由南方医科大 学南方医院血液病实验室惠赠；pRNAT-U6. 2/Lenti购于 GenScript公司；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购于QIAGEN 公司。 1.2细胞培养JURKAT细胞用含10%胎牛血清、100U/ml 青霉素和100ug/ml链霉素的RPMI1640培养液，于37°C、 5%C02恒温培养箱中培养，常规换液传代。 1.3质粒载体的构建利用Takara、AMbion和Promega siRNA靶序列分析设计系统，扫描人CXCR4 cDNA编码序列， 依据siRNA靶序列设计原则，经BLAST同源性分析。设计包 含Xhol I和BamH I酶切残端的1对靶向CXCR4发卡样DNA 寡核苷酸，由上海生工公司分别合成2对编码短发夹RNA序 列的 DNA 单链，其序列如下：5’ -GATCC GGAACCCTGTTTCCGTGAATTCAAGAGA TTCACGGAAACAGGGTTCC TTTTTTC-3? ( sense ) and 5’ -TCGAG AAAAAA GGAACCCTGTTTCCGTGAA TCTCTTGAA TTCACGGAAACAGGGTTCC G_3’ (antisense)。选取其中一个序列打乱并无基因同 源性作为阴性对照序列(NC )。其寡核苷酸序列： 5’ -GTTCTCCGAACGTGTCACGT-3’ ( sense ) and 5 -ACGTGACACGTTCGGAGAAT-3’ (antisense)，用 Xho I 和 BamH I双酶切空质粒pRNAT-U6. 2/Lenti，将退火形成的双链 定向克隆至该真核载体上，经筛选后，再进行测序鉴定。 1.4质粒转染及稳定筛选参照Lipofectamine TM2000 转染试剂盒说明书进行转染，通过脂质体将表达载体 (pRNAT-U6.2/Lenti-CXCR4-SiRNA )和空质粒 (pRNAT-U6. 2/Lenti)转染入 JURKAT 细胞，经 G418 筛选建 立稳定传代的细胞系。 1.5荧光定量PCR检测CXCR4 mRNA表达采用Trizol法 提取细胞总RNA，用AMV反转录酶进行反转录，得到总cDNAo 分别扩增目的基因CXCR4及内参对照-actin，引物序列如 下:CXCR4 上游引物 5’ - CAATGACTTGTGGGTGGTTGTG-3， 下游引物 5’ - ATGCAATAGCAGGACAGGATGA -3? ； -actin 上 游引物 5 - TGGCACCCAGCACAATGAA -3Z，下游引物 5- CTAAGTCATAGTCCGCCTAG AAGCA-37。扩增条件：95°C预变性30s，95°C变性3s， 60°C退火和延伸30s，循环40次。记录各管扩增CT值，换 算出基因拷贝数。以CXCR4基因拷贝数与-actin基因拷贝 数的比值作为CXCR4相对表达水平。 1.6 Transwell小室侵袭实验以预冷的RPMI1640与 Matrigel胶1: 1稀释后，取100 P 1稀释胶加到Transwell 上层小室中，于37°C孵育6h。收集各组细胞，消化成单细 胞悬液，用含1%胎牛血清的RPMI1640培养基重悬，按 5X 104/ml个细胞的密度将100 y 1接种于Tran swell上层小 室。吸取含10%胎牛血清或10%胎牛血清+100ng/ml SDF-1的 RPMI1640培养基500 yl加入Transwell下层小室，置于 37°C、5%C02的培养箱中培养24ho用棉签沾PBS轻轻地擦 去小室上层聚碳酸酯膜上贴壁生长但未能穿过膜的细胞。将 膜取出放