β-地中海贫血基因检测(荧光PCR熔解曲线法20141013下午)解析.ppt

* β-地中海贫血基因检测 （荧光PCR熔解曲线法） β地中海贫血是指β链的合成受部分或完全抑制的一组血红蛋白病。因本病多为点突变，故常用荧光PCR熔解曲线法确定突变类型。我国各民族的β地贫基因突变情况有一定差异，南方汉族的突变基因以CD41-42(-TCTT)、CDL7(A→T)、IVS-Ⅱ-654(C→T)和TATAbox-28(A→G)为主，占85%～90% 。 1.掌握PCR技术原理及方法，熟悉其注意事项 2.掌握荧光PCR熔解曲线法原理及方法，熟悉其应用 【目的】 PCR技术，即聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是由美国PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年（1993年获诺贝尔化学奖）建立的。这项技术可在试管内的经数小时反应就将特定的DNA片段扩增数百万倍，这种迅速获取大量单 一核酸片段的技术在分子生物学研究中具有举足轻重的意义，极大地推动了生命科学的研究进展。它不仅是DNA分析最常用的技术，而且在DNA重组与表达、基 因结构分析和功能检测中具有重要的应用价值。 【原理】 PCR技术原理 该技术是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。DNA聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下，DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3′-OH末端，并以此为起始点，沿模板5′→3′方向延伸，合成一条新的DNA互补链。而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 模板DNA(待扩增DNA) 引物 4种脱氧核苷酸(dNTPs) DNA聚合酶 适宜的缓冲液 PCR反应的基本成分包括： PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： ①模板DNA的高温变性：93℃双链DNA解离成为单链 ②模板DNA与引物的低温退火(复性)：引物与模板DNA单链的互补序列配对结合 ③引物的适温延伸：合成一条新的与模板DNA 链互补链 每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 在连续加热使DNA变性的过程中以温度对DNA溶液的A260值作图，可得一条“S”形曲线，称为解链曲线（熔解曲线） 。 解链曲线（熔解曲线）： DNA解链曲线中吸光度值达到最大吸光度值的50%时的温度称为解链温度，也称为融解温度。此时DNA分子中50%的双链被解开。 解链温度（Tm）： 荧光PCR熔解曲线法原理 荧光PCR熔解曲线法原理 野生型与突变型DNA的碱基组成不同，因此他们的Tm值和熔解曲线不同，通过比较野生型与突变型DNA的Tm值和熔解曲线，并与标准ΔTm值对照，可以确定β-基因突变型。 【操作步骤】 1.DNA获取（已准备好了） 2.PCR扩增 ： 反应液A管（做好记号）5000rpm，2秒 加入 5ul DNA溶液 总体积25微升 反应液B管（做好记号）5000rpm，2秒 加入 2.5ul DNA溶液 总体积25微升 PCR扩增条件 50℃， 2min 95℃， 10min 95℃， 15s 55℃， 15s 76℃， 20s 55cycles *