三章酶分离纯化.pptVIP

本章重点 各种分离方法的操作原理 分离方法的应用原则 酶分离纯化中应注意的问题 酶制剂的来源 3.1 酶纯化的必要性 3.2 起始材料的选择 3.3 酶的萃取 3.4 分离方法 3.5 酶纯化步骤的设计 3.6 纯化步骤的定量评价 3.7 在纯化过程中酶活力的损失 3.1 酶纯化的必要性 生物细胞中同时存在多种多样的酶。 酶在生物细胞中的分布并不是均一的。 许多酶可能作用于同一个底物。 3.2 起始材料的选择 不顾及酶的来源时，可选择酶含量高的材料。 微生物培养物 注意材料的年龄 注意在生物体内的富集区域 3.3 酶的萃取 （处理液应及时处理，否则在均浆上加一薄层甲苯可以防止微生物感染。） （1）膜和细胞壁的破碎：研磨、超声波、高压（注意胞外酶的测定） （2）酶的萃取：萃取液3倍于起始材料 缓冲液(pH 7.5)的作用，中和从空泡中放出的大量酸；高离子强度(0.1-0.5)有助于将酶从结合的膜上解析下来；丙酮粉有助于将酶与脂肪或磷脂膜分离。 注意事项：蛋白酶的抑制方法（低温快速、抑制剂） 制备丙酮粉用以解除酶与脂肪或磷脂膜的结合。 除去核酸：调整pH沉淀（鱼精蛋白硫酸盐或链霉素）、水解 3.4 酶的分离方法 （1）以大小或质量为依据：离心（300000g)、凝胶过滤（Sepha