未培养微生物 (2).ppt

nonculturable microorganisms 未培养微生物 引言 微生物： 分布最广----界定生物圈范围 生物量最大 ----占总生物量的 ~ 60% 物种及代谢多样性最为丰富 一个重要的认识 自然界中已知微生物仅占总数的不到1%。 >99%的微生物尚属未知 自然界中微生物的种数估计有10万种，但发现的仅为10% ～20%，而在人类生产和生活中仅开发利用了已发现微生物种类的1%，绝大多数在现有条件下还不能被培养出来。依照现有的培养技术和方法，不同生境微生物可培养率的检测结果如下表: 什么是未培养微生物？ 未培养微生物（nonculturable microorganisms）是指无法采用现有常规方法在实验室里培养的微生物。 自从科赫(RobertKoch)于1881年在其论文中介绍固体培养基及将混合培养物进行纯化的纯培养技术以来, 人们采用各种纯培养方法从自然环境中分离得到众多微生物的纯培养。然而人们同时也发现, 在显微镜下可以观察到的绝大部分自然环境微生物, 很难或不能通过传统纯培养分离方法得到其纯培养。于是对这类微生物进行了广泛深入的研究, 并于1982年提出了“不可培养(活)微生物” (via blebut non culturable microorganisms, VBNCmicroorganisms)的概念。Stacke brandt等将那些利用分子生物学技术能够检测到, 但还不能获得纯培养的微生物定义为“ (至今)未培养微生物” (asyetunculturedmicroorganisms)。前一定义包括那些可获得纯培养, 但在环境因子的胁迫下不能生长、处于休眠状态下的微生物。 未培养微生物存在的生态原因 共同协作的自然生存方式的崩溃 互养和共代谢，共栖、互生与共生； 急剧改变的生态位 大多数微生物的复苏不仅需要营养物质，还需要提供其群落中的小生态环境，即生态位； 生长环境的极度营养变化 对环境资源高亲和性的K型，适应低营养含量和极低的生长率； 潜在外源活性物质的缺乏 纯培养很难提供对许多细菌潜在重要的外源活性物质； 1、部分微生物生长缓慢，尚没有敏感检测技术 自然环境中微生物之间的相互关系非常复杂。 共生 是至少有一个群体为另一个群体提供其必需的生长因子从而使微生物群体获利。 当它们之间的距离靠近时------可以生长 当微生物之间距离较远或不存在时-------微生物不可培养 群体感应 它是微生物间通过感应一种信号分子来判断群体密度和环境的变化，启动相应的基因作出协调统一的应答，从而调节群体的生长。 其他类型的关系 在实验室培养条件下，单纯地将待培养的微生物与其他相关的微生物群体分开，物种之间的信息交流被阻断，微生物因缺乏必需的生长因子和信号分子而无法生长，表现为不可培养。 4、缺乏足够的认识，在实验室条件下无法实现原位培养 一、分子生物学技术在未培养微生物研究中的应用 1、基于未培养方法的rRNA 序列分析 此方法是先直接从环境样品中提取总DNA，再以rRNA 的保守区作为引物进行PCR 扩增，测定rRNA 核苷酸序列，通过序列比对，推断未培养微生物的种类和组成。可通过DGGE、SSCP、RAPD、RFLP 和文库构建等技术手段实现。 实例1： Venter等利用全基因组鸟枪测序技术对百慕大群岛马尾藻海的海水微生物进行了未培养的rRNA 序列分析，发现了至少1 800 种不同的微生物，其中148 种是以前未见报道的新类群。 实例2： Singh等首次利用未培养的方法，分析了中印度洋流域5 000 m 处海洋沉积样品中真菌的ITS区和18S rRNA 序列，共得到39 个真菌操作分类单元，其中有8 条序列是新得到序列，是以前不曾培养微生物的序列信息。 2、基于宏基因组文库和高通量测序技术的新功能基因和新活性物质的筛选 （1）宏基因组文库技术 基本思路是直接提取环境微生物的总基因组DNA, 用核酸内切酶进行部分消化, 再与载体连接, 转入宿主细胞, 构建基因文库，通过筛选文库来寻找目的基因的阳性克隆； 文库包含了可培养的和不能培养的微生物基因，避开了微生物分离培养等问题，极大地扩展了微生物资源的利用空间。是研究未培养微生物，寻找新功能基因和开发获得新活性物质的重要新途径。 由于宏基因组文库的构建对样品DNA 的质量要求较高、需要选择容量合适的载体以及构建较大的基因文库，另外大量的筛选工作和异源表达等问题也是其限制因素，所以宏基因组文库