猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA检测试验.docx

猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA检测试验 用途： 本试剂盒适用于体外检测猪血清中猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）抗体。 原理： 本试剂盒采用PRRSV纯化抗原包被微量反应板，利用间接ELISA原理进行检测。若待检血清中存在PRRSV抗体，则与包被抗原结合，加入辣根过氧化物酶标记的兔抗猪抗体后，形成抗原—抗体—酶标抗体复合物，再加入TMB底物液作用显色，在酶标仪450nm处测定各孔OD值，判定结果。 试剂盒组成： 1．PRRSV抗原包被板 2．20倍浓缩洗涤液 3．PRRSV阴性对照 4．PRRSV阳性对照 5．PRRSV样品稀释液 6．PRRSV酶结合物液 7．底物液A 8．底物液B 9．终止液 10．一次性封板膜 11．自封袋（干燥剂） 样品制备： 取猪全血，按常规方法制备血清，要求血清清亮，无溶血。 洗涤液配制： 使用前，浓缩洗涤液应恢复至室温（25℃左右），并摇动使析出的盐溶解，然后用蒸馏水或去离子水作20倍稀释（例如：每板用30ml浓缩液加上570ml水）。 样品稀释： 在稀释板中按1:10的体积比稀释待检血清（180μl样品稀释液中加入20μl待检血清）。 注意：阴性和阳性对照无需稀释。 操作步骤： 使用前所有试剂应恢复至室温（25℃），试剂应轻轻旋转或振荡混匀。 取出抗原反应板，（根据样品多少，可拆开分次使用），在记录表上记录阳性对照、阴性对照和样品的位置； 分别在相应孔中加入阳性对照（2孔）和阴性对照（2孔）原液（不用稀释），稀释好的待检猪血清各100μl。充分混匀后，贴上封板膜，置37℃孵育1小时； 小心揭掉封板膜，弃去各孔中液体、拍净。每孔加满洗涤液，静置约30秒，重复洗涤5次，最后在吸水纸上拍净； 每孔加入酶结合物液100μl，贴上封板膜，置37℃孵育30分钟； 重复步骤3； 每孔加入底物液A 50μl，再加入底物液B 50μl，轻轻振荡混匀，置37℃避光显色10分钟； 每孔加入终止液50μl，轻轻振荡混匀，置酶标仪450nm波长处测定各孔OD450nm值。 结果判定： 试验结果同时符合下列条件，方为有效： ①两孔阴性对照OD450nm平均值应≤0.20； ②每孔阳性对照OD450nm平均值应≥0.80； 按以下计算方法的判定结果： ①阳性：样品OD450nm值＞阳性对照OD450nm平均值×0.3，即PRRSV抗体阳性。 ②可疑：阳性对照OD450nm平均值×0.3≥样品OD450nm值≥阳性对照OD450nm平均值×0.25，应再进行双孔复试，若任意一孔或两孔均为阳性，则视为PRRSV抗体阳性；若两孔均为阴性则视为PRRSV抗体阴性。 ③阴性：样品OD450nm值＜阴性对照OD450nm平均值×0.25，即PRRSV抗体阴性。