枯草芽孢杆菌的分离纯化.pptVIP

枯草芽孢杆菌的分离纯化 目录 菌种简介 分离步骤 生理生化鉴定 发酵条件的优化 脂肽类抗生素的提取——酸沉淀法 脂肽类抗生素的HPLC定量检测 讨论 菌种简介 无荚膜，周生鞭毛，革兰氏阳性菌，有芽孢，菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，需氧菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。广泛分布在土壤及腐败的有机物中。 枯草芽孢杆菌在自然生长和发酵培养 产生的脂肽类抗生素具有很强的抗真菌、病毒、肿瘤、支原体活性，在防治植物病害上具有广阔的应用前景。 分离原理 芽孢杆菌能产生芽孢，在沸水中加热不会失去生理活性，但是不能产生芽孢的细菌会失去活性，因而得到芽孢菌属，经过进一步的分离及生理生化鉴定得到枯草芽孢杆菌。 分离步骤 （1）土样的采集：取土壤表层5-10cm下的肥土100g左右，把采得的土壤放入纸袋带回实验室分离。 （2）平板的制备：溶化三角瓶中的牛肉汤蛋白胨培养基，以每皿20ml左右倒6个平板。 （3）稀释分离法：称取土壤5g放入含有45ml水的三角瓶中，摇动片刻，然后将此瓶用小火加热至悬浊液沸腾，维持15min。而后静止5min，吸取上层液0.1ml加入到含有4.5ml无菌水的试管中，制成1:100浓度的悬液，然后吸取土壤悬浊液0.2ml滴加到牛肉膏蛋白胨培养基平板上，用涂布棒均匀涂布，并将培养基倒置于37℃恒温培养1-2天。 （4）挑菌及纯化：从上述分离的平板上分别挑取单菌落中部分菌体，在牛肉膏蛋白胨培养基上划线纯化。（菌体应呈杆状，具芽孢，宽度一致；菌落颜色、形状、质地、透明度等均一致） 生理生化鉴定 一 过氧化氢酶测定 将测试菌种接种于肉汤琼脂斜面上，培养1—2天。取一载玻片，在上面加一滴3—10%的过氧化氢，挑取一环菌苔，在过氧化氢溶液中涂抹，若有气泡（氧气）出现为阳性，无气泡者为阴性。 二 需氧性试验 原理：不同种类的芽孢杆菌对氧气的需求性常有差异，因此本实验可作为鉴定芽孢杆菌的一个较重要指标。 操作步骤：菌液穿刺接种到上述培养基中，一般于培养3—7天观察结果。若芽孢杆菌在琼脂柱表面生长为好氧菌，沿着穿刺线上生长者为厌氧菌或兼性厌氧菌 三、乙酰甲基甲醇实验 原理：有些芽孢杆菌发酵葡萄糖产酸，并将产生的酸进一步转化为中性化合物，如乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在碱性环境中可被氧气成二乙酰，后者与蛋白胨中精氨酸所含的胍基起作用，生成红色化合物，即表示试验阳性。若在培养基中加入少量肌酸以补充胍基，可加速反应。 培养基：蛋白胨5g，葡萄糖5g，NaCl 5g，蒸馏水 1000ml。调节PH 6.5，每管分装4—5ml，0.06MPa（8lbf/in2）30min灭菌 步骤： 将芽孢杆菌测试菌接种于上述培养液中，一般于30摄氏度培养4天，取培养液（约2ml）和等量的40%NAOH相混合，加少量肌酸（约0.5—1mg），充分振荡，2—5min后如培养液呈红色，即为试验阳性。 四 淀粉水解 原理：许多芽孢杆菌产生淀粉酶，能将培养基中的淀粉水解，淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。 培养基：在肉汤琼脂中添加0.2%的可溶性淀粉，分装于三角瓶。0.1MPa(15lbf/in2)20min灭菌备用。 步骤： 将培养基做成平板，凝固后取菌种点种于平板上（每皿点种2点），一般于30摄氏度培养2—4天，形成菌落后，在平板上滴加碘液，以铺满菌落为度，平板呈蓝色，而菌落周围如有无色透明圈出现，说明淀粉被水解，透明圈的大小，可表明水解能力的大小。 经生理生化鉴定，确定是芽孢杆菌属纯种后，从中选择一株转接于牛肉膏蛋白胨斜面上，置37℃培养1-2天后备用 发酵条件的优化 将纯化的菌种转接至LB平板上,37℃培养24h,用接种环取活化菌种,接种于100mlLB液体培养基,30℃、200r/min培养24h作为种子菌。 发酵过程中采用单因素试验方法,考察不同培养温度(26、28、30、32、34、36℃)、培养时间(26、32、38、44、50、80h)、接种量 (1%、2%、3%、5%、10%)、初始pH值(5、6、7、8、9)、培养基(Landy培养基、Landy修饰培养基Ⅰ、 Landy修饰培养基Ⅱ、LB培养基、无机盐培养基)对脂肽类抗生素产量的影响。 结果表明,最佳培养条件为Landy培养基,初始pH7·0,接种量3%,发酵培养温度30℃,发酵时间38h。 脂肽类抗生素的提取——酸沉淀法 培养结束后,7000r/min离心10min,取上清，加 HCl调节pH为5·0、4·5、4·0、3·5、3·0、2·5、2·0,7000r/min离心10min,收集沉