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微生物学实验基础培训laboratory Exercises in Microbiology 内容纲要 了解配制培养基的基本原理，掌握配制的一般方法与步骤 学习掌握高压蒸汽灭菌的操作方法 学习平板划线与接种等操作手法 实验目的 熟悉牛肉膏蛋白胨固体培养基的主要成分 液体与固体培养基的配置与灭菌 灭菌后固体培养基的分装 熟悉器皿与液体灭菌技术 熟悉高压灭菌锅的操作 熟悉培养基制备与灭菌技术 实验原理 由人工配制适合微生物生长繁殖和积累代谢产物的混合养料称为培养基。含有碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子和水等物质。 按物理状态可分为液体、半固体和固体三类。 加热密封锅体内的水，让水蒸气压力升高，提高锅内蒸汽温度而达到对物品灭菌的目的。 熟悉培养基制备与灭菌技术 实验材料 1.实验材料 高压灭菌锅；玻璃培养皿；玻璃试管，试管架；三角瓶；称重纸；电子天平；水浴锅；铝箔纸；磁力搅拌器； 2.实验药品 牛肉膏；蛋白胨；NaCl；琼脂（仅在配置固体培养基时添加）；去离子水 熟悉培养基制备与灭菌技术 实验步骤 1.培养基成分 1升培养基：5g 牛肉膏,10g 蛋白胨;5g NaCl 15g 琼脂(仅在配置固体培养基时添加);去离子水 2.按培养基配方比例依次准确称取牛肉膏，蛋白胨，NaCl加入烧杯中(固体培养基还需要加入琼脂)。 注意：蛋白胨很容易吸潮，在称取时动作要迅速，另外称药品时严防药品混杂。 熟悉培养基制备与灭菌技术 3.在上述烧杯、三角瓶中加入少于所需要的室温去离子水，放置于磁力搅拌器上搅拌，代药品完全溶解后补充水分到所需的总体积。 4.如果配置固体培养基，需要将琼脂先添加到已溶解的药品中，再加热溶化。 熟悉培养基制备与灭菌技术 5.通常，配置一升培养基需要添加200微升NaOH。对于有些要求pH值较精确的微生物，培养基的pH可用酸度计控制调节。 熟悉培养基制备与灭菌技术 6.分装 1）涂平板的固体培养基可直接用大试剂瓶灭菌。 2）根据实验要求，可将配置的完全溶解的培养基分装入试 管、三角瓶等容器进行灭菌。 注意：固体培养基约为试管高度的1/5灭菌后制成斜面。分装入三角瓶内以不超过其容积的一半为宜。半固体培养基以试管高度的1/3为宜。灭菌后垂直待凝。 熟悉培养基制备与灭菌技术 熟悉培养基制备与灭菌技术 P1.平皿包扎 P2.三角瓶包扎 P3.试管包扎 注意：灭菌时，瓶盖不能拧紧以免灭菌结束形成负压后打不开 熟悉培养基制备与灭菌技术 P1.加水 P2.装料 P3.加盖 P4.排冷空气 ℃ MPa 0 108 115 121 126 135 138 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 压力表 P5.升压 P6.保压 P7.降压 P8.开锅取料 倒平板的过程靠近酒精灯（10-15cm 范围），倒完后迅速将培养皿盖上，待冷却凝固后，将培养皿翻转放置于台上，待用； 若暂时不需要使用，则用封口膜缠绕后翻转放置于4℃冰箱，待用。 熟悉培养基制备与灭菌技术 P1.摆斜面 将灭菌好的试管如图放置，凝固后即成斜面 P2.倒平板 另外一只手拿起三角瓶 倒入量为15-20mL，2-3mm高 15-20mL，2-3mm高 实验目的 正确使用接种环 熟悉在无菌环境下转移与重新培养 熟悉划平板技术 熟悉细菌数量计数的方法 了解细菌长期保存技术 平板划线与细菌数量计数 实验原理 平板划线法是指把杂菌样品通过在平板表面划线稀释而获得单菌落的方法。 菌落形成单位(CFU，Colony-Forming Units)指单位体积中的活菌个数。在活菌培养计数时，由单个菌体或聚集成团的多个菌体在固体培养基上生长繁殖所形成的集落，称为菌落形成单位，以其表达活菌的数量。 平板划线与细菌数量计数 平板划线与细菌数量计数 （1）标记 在培养皿底面，用记号笔注明接种的菌名、接种者姓名、日期等。 （2）灭菌接种环 点燃酒精灯，右手以持笔式握持接种环，并放置火焰中烧灼灭菌，先将接种环的接种丝部分置于火焰中，待金属丝烧红并蔓延至金属端，再直接烧灼金属环直至烧红，然后由金属环至金属杆方向快速通过火焰，随后再反方向通过火焰，如此2~3次。然后将接种环移开火焰，待其冷却。 平板划线与细菌数量计数 平板划线与细菌数量计数 （3）取菌种 左手持装有菌液的试管，用持有接种环的右手手掌及小指拔取试管塞，将试管管口迅速通过火焰2~3次进行灭菌。 将已灭菌且已冷却的接种环伸入菌种管中，取一接种环的菌液，然后退出菌种管，将菌种管管口再次通过火焰2~3次灭菌，塞好试管塞，放至原来的位置。 平板划线与细菌数量计数 （4）分离划