基因工程第6章节 dna重组的操作1资料.pptVIP

Review 第三部分 目的基因的分离 目的序列已知： 一般采用PCR技术或分子杂交技术分离克隆目的基因 目的序列未知： 差异表达序列 无差异表达的目的序列，可采用文库筛选法、功能蛋白分离法、序列克隆法 一、目的基因的功能克隆 根据蛋白质的基本生化特性这一功能信息，在获知基因的功能后克隆 其具体作法是:在纯化相应的编码蛋白后构建cDNA文库或基因组文库，然后从文库中筛选目的基因 (1)将纯化的蛋白质进行氨基酸测序，据此合成寡核苷酸探针从cDNA库或基因组文库中筛选编码基因 (2)将相应的编码蛋白制成相应抗体探针，从cDNA表达文库中筛选相应克隆。 二、 序列克隆法 根据已知基因序列或同源基因序列分离目的基因 采用核酸探针杂交筛选或用PCR技术进行分离 三、差别杂交法 适用范围： 组织特异性表达或特定发育阶段表达的基因 受生长因子调节的基因 经特殊处理诱导表达的基因 基本过程 制备两种细胞群体的的mRNA提取物 以两种总mRNA或cDNA为探针 以表达目的基因的细胞群体构建cDNA文库 有目的基因表达的mRNA探针，重组体菌落阳性反应 目的基因不表达的mRNA探针，除目的基因之外，其余菌落都为阳性反应 比较底片，对照原板，可挑选出含选目的基因的菌落 四、减法杂交技术 又称差减杂交、扣除杂交、减数杂交、消减杂交 本质：尽量去除两种样品中普遍共同存在的基因序列，从而使目的基