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动植物组织样品代谢产物提取 　　　　新一代靶向代谢组学测试用动植物组织样品中代谢产物的提取方法 　　李克峰博士 　　实验背景和目的 　　代谢(Metabolism)是维持生物体功能进行的各类生化反应的总称。代谢产物(Metabolites)是参与生物体内代谢的小分子化合物，其分子量一般在1200Da 以下。代谢产物具有非常重要的功能，是基因、蛋白与环境作用的直接反应。新一代靶向代谢组学技术 (Next-generation Targeted Metabolomics) 是近几年随着检测仪器的更新，刚刚发展起来的代谢组学新技术，旨在测定生物体内所有小分子的代谢产物的绝对浓度，了解其在疾病 (Diseases)、胁迫 (Stresses)等条件下的变化，进而揭示表观现象后的分子机制。动植物组织 (Tissues) 是代谢组学测试常常遇到的材料。由于组织样品为不流动的固体，细胞壁厚，细胞排列紧密，代谢产物种类多，化学性质差异大等特点，而靶向代谢组学要求提取尽可能多的代谢产物，这给代谢产物提取带来了很大挑战。 　　传统的提取方法需要两部提取法，第一步通过甲醇-水进行极性化合物的提取，第二步通过氯仿进行非极性代谢产物的提取。两步提取法，步骤繁琐，而且使用的氯仿毒性较大。本文(Protocol)优化了一种简单有效的广谱提取方法，只需要一步方法，就可以提取极性和非极性代谢产物。 　　需要准备的材料和器材 　　(1) 代谢产物提取液 (甲醇-乙腈-丙酮-水 (30:30:30:10； V/V/V) 含13C 内标化合 　　物；提前放置-20 oC 冰箱预冷) （必须加入代谢产物同位素内标物，以便后续数据校正）（色谱纯级试剂） 　　(2) 液氮 　　(3) 研钵（提前在-20 oC 冰箱预冷） 　　(4) 碎冰或者冰盒 　　(5) 涡旋仪 　　(6) 低温高速离心机（提前置于4 oC 预冷） 　　(7) SpeedVac/lyophilize或者氮吹干，或者在通风厨挥干 　　(8) 超声波提取仪 　　(9) 移液枪、枪头、离心管、Marker 笔、手套、白大褂防护设备等 　　(10) 动物实验需要的操作需要提前得到医学伦理委员会的批准 　　动植物组织中代谢产物提取步骤（需要时间约为：40分钟） 　　[1]取动物或者植物组织（以大鼠左侧海马组织为例，下同），置于研钵中，加液氮快速研磨。 　　(1) 为保证靶向代谢组学得出的科学研究结论的准确性，对于动物组织，每组至少 　　需要12个样本，对于植物组织，至少需要8个样本。 　　(2) 研钵提前在-20 oC 冰箱预冷，研磨时要快速。 　　(3) 液氮非常冷，要带防冻手套，注意冻伤。 　　(4) 可同时处理12个样品。 　　[2] 取1.5 ml 离心管，加入研磨的海马组织粉末，置于精密天平准确称重（约50 mg 左右），记录湿重。 　　(1) 提前标记离心管，并准确称重离心管的重量。 　　[3]根据湿重，加入9倍体积的提前预冷的提取液，涡旋混匀。 　　(1) 动植物组织粉末重量=（粉末重量+离心管重）-离心管重量。 　　(2) 如果重量为48.5 mg，则加入48.5*9=436.5 μl 的提取液。 　　(3) 这里的提取液中加入了丙酮，帮助细胞膜裂解、提高动物组织中，心磷脂 　　(cardiolipin)、神经鞘氨(ceramides)等脂类化合物的回收率。 　　[4] 在冰上静置10~15分钟，使提取液和动物组织粉末充分反应。 　　(1) 此步骤的主要目的是裂解细胞壁、沉淀蛋白、DNA 等大分子物质。 　　(2) 如果研磨的颗粒不是很充分，此处也可以置于超声波水浴中（含冰），超声 　　10分钟，注意不要使冰融化。 　　[5] 高速低温离心 (16000 g, 4 oC) ，10 分钟，管中上清液为小分子代谢产物，包括极性代谢产物和非极性代谢产物（磷脂类、脂肪酸、肉碱、胆固醇等）。 　　(1) 离心速度至少要在10000 g 以上。 　　(2) 管底部沉淀为DNA 、蛋白等大分子物质。 　　(3) 管底含有有机溶剂，为有害物质 (Biohazards)，需要专门收集处理。 　　[6]取上清液，转移到新的离心管中，氮气吹干即可（也可直接进样）。 　　(1) 根据仪器的灵敏度，也可将上清液直接取样，用LC-MS/MS 分析。 　　(2) 取样时，小心不要取到底部的沉淀。 　　(3) 另外，不需要取出所有的上清液，如果是总体积为500 微升，取200微升到新 　　的离心管中，液氮吹干即可，剩余的上清液，可转移到另一个新的离心管中，保存在-80 oC 冰箱，作为备份。 　　(4) 代谢产物在加入提取液沉淀蛋白，去除酶以后，特别是吹干后，绝大部分是非 　　常稳定的。可在室温下放置大约1个月的时间，没有显著