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基因工程研究 第一个重组体的构建 1972年,美国斯坦福大学P.Berg等在PNAS上发表了题为∶“Biochemical methode for inserting new genetic information into DNA of Simian Virus 40:circular SV40 DNA molecules cotaining lamda phage genes and the galactose operon of Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2904-2909, 1972”, 标志着基因工程技术的诞生。 (基因工程技术包括下列过程) 分─获取目的基因和载体 接─目的基因与载体的连接 转─重组DNA导入宿主细胞 筛─重组DNA的筛选 鉴─重组DNA的鉴定 可用以上五个字表示 (一)目的基因的分离(分) 目的基因:是指所要研究或应用的基因,也是需要克隆或表达的基因。 (一) 目的基因的分离 1、基因分离的策略 一般分离基因的策略要满足以下几个基本特性中的至少一个: (1)具有特定的核苷酸序列;(2)存在于基因组中某一特定位置;(3)编码mRNA;(4)大多具有一定的功能。 2、基因分离的注意事项 (1)以基因表达产物蛋白质的纯化或表型突变体的分离; (2)通过植物细胞工程、物理和化学诱变等技术,获得植物基因; (3)可在cDNA文库中随机取一个克隆; (5)采用染色体步移(chromosomal walking)方法分离基因出来; (6)许多植物基因可以根据其与细菌和酵母突变互补能力来分离; (7)许多有潜在利用价值的植物基因。 (二)目的基因的制备 1)化学合成法 根据已知多肽链的氨基酸顺序,利用遗传密码表推定其核苷酸顺序再进行人工合成。适应于合成小分子多肽的基因 全基因合成:合成40-60bp片段,再连接 合成思路 基因的半合成:合成末端间有10-14bp个互补碱基的 片段,再利用DNA聚合酶催化合成 目前,常用DNA自动合成仪合成。 3、cDNA文库法 cDNA文库(cDNA library):是指汇集以某生物成熟mRNA为模板逆转录而成的cDNA序列的重组DNA群体 操作流程:提取出组织细胞的全部mRNA,在体外反转录成cDNA,与适当的载体,常用噬菌体或质粒载体连接后转化受体菌,则每个细菌含有一段cDNA,并能繁殖扩增,这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合就形成了该组织细胞的cDNA文库。 实际为不包含内含子的基因组文库。 (三)聚合酶链反应( PCR) 在模板DNA、引物、dNTP、Taq DNA聚合酶等条件下,体外经94℃变性、54℃退火及72℃延伸3个步骤的反复多次循环(25?30次),扩增目的基因 (一)质粒DNA的分离和纯化 载体的本质是DNA,所以其分离纯化类似于DNA的分离纯化 纯化步骤: 质粒载体宿主菌 释放出质粒DNA、多聚核糖体、可溶性蛋白质、tRNA等细胞内大分子 DNA 除去蛋白 质粒DNA 与核内环性和线性DNA分开 (二)目的基因与载体的连接 1、粘性末端连接 将目的基因和载体用同一种限制酶酶切,产生相同粘性末端,再通过DNA连接酶作用将两者连接起来,构成重组DNA分子。 2、平头末端连接 某些限制酶只能将目的基因和载体DNA切割成平端,此时在T4DNA连接酶的作用下同样能连接起来。 4、同源多聚尾连接法 也称作人工接尾连接法 当载体和目的基因无法采用同一种限制酶进行切断,无法得到相同得粘性末端时,可采用此方法。 此法首先使用单链核酸酶将粘性末端切平,再在末端核苷酸转移酶的催化下,将脱氧核糖核苷酸添加于载体或目的基因的3-端,如载体上添加一段polyG,则可在目的基因上添加一段polyC,故二者即可通过碱基互补进行粘合,再由DNA连接酶连接。 三、将重组体导入受体细胞 (转) 根据受体生物,可将重组体导入受体细胞的方法主要分为大肠杆菌转化法、酵母转化法、植物细胞转化法及动物细胞转化法 (一) 大肠杆菌转化法 1、氯化钙转化法(