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外源目的基因的取得 限制性核酸内切酶 Ⅰ型限制酶 寄主微生物属名的头一个字母和 种名的前两个字母 不同限制酶能专一地识别不同的特异核苷酸 序列 粘性末端：限制酶错位切断DNA双链而形成 的具有彼此互补碱基的单链延伸末端。 同裂酶：来源不同的限制酶识别的是同样的核苷 酸靶子序列 将两段DNA拼接起来的酶称为DNA连接酶 DNA聚合酶是指能够催化DNA复制和修复DNA 分子损伤的一类酶。 切口平移反应：当双链DNA的一条链产生缺 口时，DNA聚合酶Ⅰ的5′ 3′聚合酶将脱氧 核苷酸添加到3′-OH末端上，与此同时，其 5′ 3′核酸外切酶从缺口的5′-P末端切除 原有核苷酸，使切口沿着DNA平移。亦称缺 口翻译。 克隆载体：具有在细胞内自我复制能力的 DNA分子。 质粒：是一些存在于微生物细胞内染色体外 的小型闭合环状双链DNA分子，是能够进行 独立复制并保持恒定遗传的复制子。 质粒DNA分子构型： 共价闭合环分子(cc) 开放环分子(oc) 质粒DNA的提取与纯化 氯化铯密度梯度离心法 微量碱变性法 具有尽可能小的相对分子量 应属于松弛复制型 应为非传递性质粒 1.氨苄青霉素抗性基因（Ampr） 优越性 噬菌体是“捕食”细菌的生物，是感染 细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物 的细菌病毒的总称。 感染阶段 增殖阶段 成熟阶段 噬菌体只含有 蛋白质和DNA。 历史上，生物学家在细胞中总是没有办法找 到承担遗传功能的物质，曾经一度认为蛋白 质是遗传物质，因为它承担了生命活动的绝 大部分功能。 1952年赫尔希(Hershey)和沙斯(Chase)两人利 用噬菌体证明了DNA的遗传功能，为最终确 立DNA是主要的遗传物质奠定了基础。 1951年，Esther Lederberg证实大肠杆 菌K12中有原噬菌体。 λ噬菌体结构 λ噬菌体DNA分子 λ噬菌体DNA分子 λ噬菌体DNA的复制 λ噬菌体基因组的机构和功能 质粒重组子的挑选 λ重组子的挑选 常用的λ 噬菌体载体 1. λgt系列载体 （1） λgt10载体 （2）λgt11载体 Charon 40载体 黏粒载体 黏粒是由人工构建的含有λ噬菌体DNA 的cos序列和质粒复制子的载体。黏粒的 组成包括质粒复制起点（ColE1）、氨苄 青霉素抗性标记、cos位点。 黏粒载体 cos位点是λ噬菌体头部组装时的识别序 列，因而黏粒能包装入λ噬菌体颗粒后 感染大肠杆菌。 黏粒载体 特点： 1. 具有λ噬菌体的特性。黏粒在克隆了外源DNA在体外包装成噬菌体颗粒后，可以感染宿主菌并在细菌内按照λ噬菌体DNA的方式环化起来。但黏粒载体不含有λ噬菌体的全部必要基因，因此不会使宿主菌裂解，无法形成子代噬菌体颗粒 黏粒载体 黏粒载体 特点： 2. 具有质粒的特性。黏粒具有质粒复制子，可在宿主菌内像质粒DNA一样进行复制。而且还具有抗性标记。 黏粒载体 特点： 3. 克隆外源DNA的容量大。黏粒自身相对较小，一般只有5～7kb，而最大的克隆片段可达45 kb左右。 4. 能与有同源序列的质粒进行重组。 c2RB黏粒载体 含有两个cos位点，两个抗性基因，一个复制起点，4 个限制酶切位点。 pJB8黏粒载体 由质粒pAT153派生而来的，能克隆大片段的外源 DNA，适用于构建真核基因组的基因文库。 M13噬菌体载体 M13噬菌体是一种丝状噬菌体，内有一个环状单 链DNA分子，长6407个核苷酸，含DNA复制和噬菌 体增殖所需的遗传信息。M13DNA的复制起始位点定 位在基因间隔区内。但是基因间隔区的有些核苷酸序 列即使发生突变、缺失活插入外源DNA片段，也不会 影响M13DNA的复制，这为M13DNA构建克隆载体提 供了条件。 特点： 1.不杀死宿主细胞 2.形成噬菌斑 3.只能感染带有F性纤毛的大肠杆菌 3.经感染、复制后，变成双链增殖型DNA 复制过程： 1.吸附 2.单链DNA进入受体细胞 3.（-）链DNA的合成，形成双链 4.合成新的（+）链DNA 5.（+）链DNA与结合蛋白的结合与脱落 6. 子代M13噬菌体的装配 M13载体的构建 1.M13mpl 2.pUC18 基因工程药物目的基因的制取 基因工程先决条件： 获得所需要的目的基因。 方法 1.化学合成法 2.构建基因文库法 3.酶促合成法 目的基因的化学合成 步骤： 1.目的基因的设计 计算机辅助设计 需考虑的问题 1.寡合苷酸片段划分的长度 2.限制酶位点 3.排除基因内部正反向重复顺序 目的基因的化学合成 4.选择表达宿主细胞偏爱的密码子 5.加起始与终止密码子 6.基因表达因素 寡核苷酸： 是一类只有20个以下碱基对的短链核苷酸的总称（