本科《细胞生物学实验》讲义.docxVIP

实验一、光学显微镜的基本使用方法 一、实验目的 1. 了解光学显微镜的结构、原理和保养方法； 2. 掌握光学显微镜的操作。 二、实验要求 1．遵守实验室安全制度，听从指导教师安排； 2．认真听讲，不懂就问； 3．完成实验报告 三、实验仪器和材料 1．光学显微镜、擦镜纸、香柏油、二甲苯 2．微生物示范片：蛙血涂片 四、显微镜的结构、光学原理及其操作方法 （一）显微镜的结构和光学原理 显微镜分机械装置和光学系统两部分。 1．机械装置 （1）镜筒：镜筒上端装目镜，下端接转换器。镜筒有单筒和双筒两种。单筒有直立式（长度为160mm）和后倾斜式（倾斜45°）。双筒全是倾斜式的，其中一个筒有屈光度调节装置，以备两眼视力不同者调节使用。两筒之间可调距离，以适应两眼宽度不同者调节使用。 （2）转换器：转换器装在镜筒的下方，其上有3个孔，有的有4个或5个孔。不同规格的物镜分别安装在各孔上。 （3）载物台：戴物台为方形（多数）和圆形的平台，中央有一光孔，孔的两侧各装1个夹片，载物台上还有移动器（其上有刻度标尺），可纵向和横向移动，移动器的作用是夹住和移动标本用。 （4）镜臂：镜臂支撑镜筒、载物台、聚光器和调节器。镜臂有固定式和活动式 （可改变倾斜度）两种。 （5）镜座：镜座为马蹄形，支撑整台显微镜，其上有反光镜。 （6）调节器：调节器包括大、小螺旋调节器（调焦距）各一个。可调节物镜和所需观察的物体之间的距离。调节器有装在镜臂上方或下方的两种，装在镜上方的是通过升降镜臂来调焦距，装在镜臂下方的是通过升降载物台来调焦距，新式显微镜多半装在镜臂的下方。 2．光学系统及其光学原理 （1）目镜：每台显微镜备有3个不同规格的目镜，例如，5倍（5×）、10倍（10×）和15倍（15×），高级显微镜除了上述三种外，还有20倍（20×）的。 （2）物镜：物镜装在转换器的孔上，物镜有低倍（8×、10×、20×三种）、高倍（40×或45×）及油镜（100×）。物镜的性能由数值孔径（N.A.）决定，数值孔径=n. sinα/2，其意为玻片和物镜之间的折射率乘上光线投射到物镜上的最大夹角的一半的正弦。光线投射到物镜的角度越大，显微镜的效能越大，该角度的大小决定于物镜的直径和焦距。n是影响数值孔径的因素，空气的折射率n=1，水的折射率n=1.33，香柏油的折射率n=1.52，用油镜时光线入射α/2为60°，则sin60°=0.87。 以空气为介质时：N.A.=l×0.87=0.87 以水为介质时：N.A.=1.33×0.87=1.16 以香柏油为介质时：N.A.=1.52×0.87=1.32 显微镜的性能还依赖于物镜的分辨率，分辨率即能分辨两点之间的最小距离的能力。分辨率用表示，（为波长），分辨率与数值孔径成正比，与被长成反比。增大数值孔径，缩短波长可提高显微镜的分辨率，使目的物的细微结构更清晰可见。事实上可见光的波长（0.38～0.7）是不可能缩短的，只有靠增大数值孔径来提高分辨率。 物镜上标有：N．A．1．25、100×、“OI”、160/0.17、0.16等字样，其中N．A．1.25为数值孔径，100×为放大倍数，“160/0.17”中160表示镜筒长，0.17表示要求盖玻片的厚度。“OI” 显微镜的总放大倍数为物镜放大倍数和目镜放大倍数的乘积。 （3）聚光器：聚光器安装在载物台的下面，反光镜反射来的光线通过聚光器被聚集成光锥照射到标本上，可增强照明度，提高物镜的分辨率。聚光器可上、下调节，它中间装有光圈可调节光亮度，在看高倍镜和油镜时需调节聚光器，合理调节聚光器的高度和光圈的大小，可得到适当的光照和清晰的图像。 （4）反光镜：反光镜装在镜座上，有平、凹两面，光源为自然光时用平面镜，光源为灯光时用凹面镜。它可自由转动方向。反光镜可反射光线到聚光器上。 （5）滤光片：自然光由各种波长的光组成，如只需某一波长的光线，可选用合适的滤光片，以提高分辨率，增加反差和清晰度。滤光片有紫、青、蓝、绿、黄、橙、红等颜色。根据标本颜色，在聚光器下加相应的滤光片。 图1.普通光学显微镜 五、实验步骤及内容 1．低倍镜的操作 （1）置显微镜于固定的桌上。窗外不宜有障碍视线之物。 （2）旋动转换器，将低倍镜移到镜筒正下方，和镜筒对直。 （3）转动反光镜向着光源处，同时用眼对准目镜（选用适当放大倍数的目镜）仔细观察，使视野亮度均匀。 （4）将标本片放在载物台上，使观察的目的物置于圆孔的正中央。 （5）将粗调节器向下旋转（或载物台向上旋转），眼睛注视物镜，以防物镜和载玻片相碰。当物镜的尖端距载玻片约0.50cm （6）左眼向目镜里观察，将粗