病毒的分离鉴定..pptVIP

病毒分离鉴定与常用序列分析软件简介 云南省地方病防治所 病毒立克次体病防治科 冯 云 E-mail:ynfy428@163.com 2012.5.30 一、病毒的分离 标本的处理 蚊虫；蜱；蠓等； 血清；脑脊液等； 动物组织标本（脑，肺，脾等） 病毒的分离 动物接种 组织培养 鸡胚培养 蚊虫饲养分离病毒 强调点：实验室生物安全 实验室安全是重中之重，如果实验室的条件不具备，建议不要开展病毒分离工作； 在进行相关实验的时候一定要严格按步骤操作； 实验过程中一定要做好严格防护。 * * “全程冷链” 1．动物接种 动物分离病毒法：乳小白鼠（3日龄） 优点：很敏感，易掌握；病毒可随传代次数的增加而增强，有利于病毒分离； 缺点：小白鼠本身存在多种病毒性疾病，往往会影响结果；小鼠也可能存在个体差 异； 接种途径： 脑内接种 皮下接种 皮内接种 腹腔接种 肌肉接种 静脉接种 实验动物的观察： 动物的发育、活动力、食欲和粪便 特殊症状：震颤、弓背、不安、嗜睡、瘫痪、抽搐等直至死亡 有些实验还需测量动物的体温和体重 （1）原代和次代细胞培养 （2）二倍体细胞培养 （3）传代细胞培养 （4）病毒在培养细胞中增殖的指标 1）细胞病变 2）红细胞吸附 3）干扰现象 4）细胞代谢的改变 组织培养分离法： 没有隐性感染 没有免疫能力的抵抗力 接种量大 培养条件易于控制 加速病毒的分离过程 汉坦病毒敏感的培养细胞 首先发现人肺癌细胞（A549） 其他敏感细胞： Vero-E6、2BS、RL、CEC等 2．组织培养 细胞病变（CPE ）： 1、分布均匀的小颗粒状破坏病变； 2、局灶状小颗粒状破坏； 3、细胞圆化，呈局灶性葡萄状的堆积； 4、细胞融合。 圆缩； 脱落； 聚集； 破碎； 3．鸡胚培养 优点：对大多数病毒均较敏感，其病毒繁 殖量较高； 来源方便、经济，管理方便； 缺点：操作不当污染，导致胚胎死亡； 4．蚊虫分离病毒法 经口感染 胸腔接种 优点：病毒可长时间保存在蚊体内； 蚊虫饲养较实验动物容易，数 量大； 缺点：必须经常了解蚊子体内是否确 已带毒； 1）蚀斑（plaque）测定 可进行病毒的分离纯化； 蚀斑形成单位（plaque forming unit, PFU） 2）50%感染量或50%组织感染量（ID50或TCID50）测定 （一）病毒的数量与感染性测定 二、病毒的鉴定 结晶紫染色 中性红染色 1）病毒核酸类型的测定 2）理化性状的检测：大小及结构、衣壳对称类型、有无包膜等 3）血清学鉴定 ELISA；IFA； （二）病毒理化性质及血清学鉴定 阳性分离物上清 提取总RNA 反转录合成cDNA 直接测序或克隆测序 PCR扩增 （三）病毒分子生物学鉴定 什么是聚合酶链式反应 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR） 是一种在体外特异地扩增已知基因的方法； 由K. Mullis于1983年建立； 可用于分析基因及其产物的水平变化； 可进行实时、定量分析； 可结合免疫沉淀的方法确定蛋白质与DNA序列的相互作用。 PCR技术的工作原理 PCR操作过程 1、预变性（Initial denaturation）： 模板DNA完全变性对PCR能否成功至关重要，一般95℃加热3-5分钟； 2、引物退火（Primer annealing）：退火温度一般需要凭实验经验决定，退火温度对PCR的特异性有较大影响； 3、引物延伸（Primer elongation）：引物延伸一般在72 ℃进行（Taq酶最适温度），延伸时间随扩增片段长短而定； 4、循环中的变性步骤：循环中一般95℃，30秒足已使各种靶DNA序列完全变性，变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败； 5、循环数：大多数PCR含25-35个循环，过多易产生非特异条带； 6、最后延伸：在最后一个循环后，反应在72 ℃维持5-15分钟，使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。 PCR的各种变体 反向PCR（Inverse PCR，IPC