小鼠DNA甲基转移酶1(DNMT1).docVIP

上海邦奕商贸有限公司 PAGE PAGE 1 小鼠DNA甲基转移酶1(DNMT1) 产品编号：MED086 Elisa试剂盒使用说明书 用途 本试剂盒仅供科研使用，定量检测细胞液、体液、组织、血清、血浆等标本中小鼠DNA甲基转移酶1(DNMT1)的含量。 原理: 采用双抗体夹心法测定小鼠DNA甲基转移酶1(DNMT1)水平。用纯化的小鼠DNA甲基转移酶1(DNMT1)抗体包被微孔板，制成固相载体，实验时依次在微孔板中加入样本及标准品，并加入HRP标记的DNMT1抗体，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，反复洗涤后加底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化为蓝色，再用硫酸终止反应，转变成黄色。颜色的深浅和样品中的DNMT1含量呈正相关。采用酶标仪在450nm波长测定吸光度（OD值），根据标准曲线，计算测试样品中DNMT1浓度。 试剂盒组成 序号 名称 规格 1 酶标包被板 96孔*1可拆卸板 2 酶标试剂 6ml*1瓶 3 标准品(浓度2000 pg/ml) 0.6ml*1瓶 4 标准品稀释液 2ml*1瓶 5 生物素标记的抗DNMT1抗体 1.5ml*1瓶 6 显色剂A液 6ml*1瓶 7 显色剂B液 6ml*1瓶 8 终止液 6ml*1瓶 9 浓缩洗涤液（*30） 20ml*1瓶 10 封板膜 1张 11 使用说明书 1份 实验材料与试剂配制： 仪器与材料：酶标仪（使用前预热30分钟），微量加液器、吸头、蒸馏水或去离子水，滤纸。 2. 洗液的配制：按1:30的比例配制洗液备用。 样品收集、处理及保存 细胞培养上清：适用于检测体外培养的细胞分泌性成份。用无菌管收集细胞上清液，以1000×g离心15分钟，收集上清。 细胞：用PBS反复洗涤细胞3次，调整细胞浓度达到104-106/ml 左右，通过反复冻融，使细胞破坏并放出细胞内成份，或者细胞超声粉碎，离心取上清液检测。 血清：在室温下，血液自然凝固，以1000×g离心15分钟，取上清待测。 血浆：应根据标本的要求选择EDTA 或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合后静置10-20 分钟后，以1000×g离心15分钟，收集上清。 体液：包括胸腹水、脑脊液，分泌物等。使用不含热原和内毒素的离心管收集，以1000×g离心15分钟，收集上清。 组织标本：切取组织标本，称取重量0.5mg，加入500ul 的PBS，用手工或匀浆器，或超声破碎仪将标本匀浆，以2000-3000 rmp离心20 分钟，收集上清进行检测。 样品中不能含有NaN3，因NaN3 抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。 保存：如果样品不能立即检测，应将其分装，-70 ℃保存，避免反复冷冻。保存过程中如出现沉淀，应再次离心。血液标本尽可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中含大量颗粒，检测前先离心或过滤。不要在37℃或更高的温度加热解冻。应在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。 操作步骤： 取出试剂盒，室温（20-25℃）放置30分钟。 分组：取出96孔板，根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数，把剩余的板条继续冷藏处理。分别设标准品组（6个浓度）、空白孔、待测样品组。 标准品的稀释：准备小试管6 只，依次编好号码，先在各小试管中加入标准品稀释液100ul，然后取原浓度标准品100ul 加入一只已编好号的试管中，充分混匀;再在该试管中取100ul 加入第二支试管中，充分混匀；再在该试管中取100ul 加入第三只试管中，充分混匀；再在该试管中取100ul 加入第四只试管中，充分混匀；再在该试管中取100ul 加入第五只试管中，充分混匀；然后在该试管中取100ul，弃掉。第六只试管作为0 号标准品。稀释后各管浓度分别是：1000pg/ml,500pg/ml,250 pg/ml,125pg/ml,62.5 pg/ml ,0 pg/ml。 注：为减少实验误差，保证准确性，建议设置复孔。 加样：依照标准品的顺序分别加入50ul的标准品溶液于空白微孔中；空白对照孔加入50ul的蒸馏水；其余微孔中先加样品40ul然后再加生物素标记的抗DNMT1 抗体10ul。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 温育：用封板膜封板后置37℃温育30 分钟。 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加