转录调控-研究生教学课件.ppt

真核生物基因转录调控研究 的进展和方法 周 建 林 顺式作用元件 是指对基因表达有调控活性的DNA序列，其活性只影响与其自身同处于一个DNA分子上的基因 非编码序列 分为：启动子、增强子、沉默子、绝缘子 反式作用因子trans-acting factor 概念：通过识别和结合顺式作用元件的核心序列,而调控靶基因的转录效率的一类蛋白因子（转录因子），对基因表达调控可正(激活)可负(阻遏) 。 类别：基本转录因子、上游转录因子和可诱导转录因子 启动子(Promoter) 概念：启动子是基因序列中决定转录起始的部位。包括核心启动子和上游启动子元件 。 Primer extension(引物延伸) S1 nuclease mapping Primer extension and S1 nuclease digestion Search for evolutionary conserved transcription factor binding sites. rVista 2.0 (/) ConSite ( ) Gel retardation(凝胶阻滞)/electrophoretic mobility shift assay (EMSA, 电泳迁移率变动分析) 增强子（enhancer） 基因组中能增强邻近基因启动转录的序列。最早发现于SV40的基因上游，含2个72bp的正向重复序列。 增强子特性 1.增强效应非常明显 10~200倍 。 2.与其位置、取向无关（上下游、距离） 3.核心序列是重复序列,是增强效应所必须 4.有细胞组织特异性， 需与特异蛋白因子作用 5.无基因特异性 6. 要有启动子才能发挥作用  – consists of several good binding sites of TFs – the sites are spatially clustered together – the pattern of sites is conserved Enhancer Element Locator http://www.cs.helsinki.fi/u/palin/EEL/ Insulator (绝缘子) 一种负调控元件，参与基因表达的负调控。干扰增强子与启动子的相互作用，并抑制启动子的激活活性。 CTCFBSDB: a CTCF binding site database for characterization of vertebrate genomic insulators : / CTCF vs. BORIS CTCF 11个与DNA结合的锌指结构域 与绝大多数的ICRs以及CpG岛结合 结合是甲基化敏感的 具有绝缘子功能 具有边界元素的功能，例如阻断异染色质的传播 保护相应区域不被甲基化 广泛表达，尤其在精母细胞中表达量高 过表达抑制细胞的增殖 基因定位于16q22, 在癌症中常发生突变或缺失 4、反式元件与顺式元件的相互作用对转录的影响 （1）定点突变→荧光素酶活性分析 （2）过表达转录因子→测定目的基因的表达 （3）干扰转录因子的表达→测定目的基因的表达 （4）转基因动物 定点突变 Bulger and Groudine. 2002. Nature Gen. 32:555-557 Models for Enhancer Action Characterization of an enhancer? Assays for Enhancers Transient transfection DNAase I hypersensitivity DNAase I footprinting/mutation analysis Transgenic mice Transient Transfection: P Luciferase E P Luciferase E P Luciferase 3.7 Insulator function in Imprinting Two linked Imprinted Genes: Maternal [H19 (on), Igf2 (off)] Paternal [H19 (off), Igf2 (on)] H19 Igf2 Effects of insulators on enhancer–promoter interactions CTCF is the only protein identified so far in vertebrate that binds to insulators and shows en