第四章-透射电子显微分析技术二.pptVIP

第四章 透射电子显微分析技术（二） 推荐一本参考书 《生物医学电镜样品制备方法》 -----戴大临 张清敏 著 透射电镜生物医学试样的制备 一 超薄切片技术 超薄切片的常规程序 超薄切片使用的设备 超薄切片使用的试剂及配方 二 生物样品的负染色技术 一、 超薄切片技术 透射电镜生物医学试样超薄切片的制作过程 需要经过取材、固定、清洗、脱水、浸透、包埋（聚合）、切片及染色等步骤。 超薄切片常规程序 取样：大小1mm3； 醛类(如戊二醛）预固定：2-4小时； 缓冲液清洗几次，中间更换新的缓冲液； 锇酸后固定： 0-4℃下 1-4小时； 缓冲液清洁半小时以上； 乙醇或丙酮的上升系列脱水，其顺序为：50%，70%，80%，90%，95%各一次，每次5-15分钟，100%2-3次，每次5-15分钟； 包埋剂浸透，包埋； 聚合，60℃下聚合24-36小时，或者在紫外线下聚合24-48小时； 超薄切片 染色 图解超薄切片试样制备过程 （－）取 材 1.取材的基本要求： 快　取材的动作要迅速，最好在材料离体后１min内就进入固定液；解剖器械要锋利，避免牵拉和挤压，尽量减少取材中的机械损伤。 准　取材要准确。①　器官要准确　②　部位要准确：如脑垂体的前叶和后叶要分清，其结构和功能各不相同。 冷　取材过程应尽量在低温下进行（０～４℃），以降低酶的活性，减少细胞内结构的损失。 小　所取材料体积要小，一般不超过１㎜3。因为固定剂的渗透力较弱，若组织块太大，块的内部将得不到良好的固定。 2.取材方法 A．动物及人体组织的取材： 应在麻醉（1%戊巴比妥钠按5ml/kg体重腹腔注射）或断头急性处死后，解剖出所需器官，用解剖剪刀剪取一小块组织，放在干净的纸板上，滴一滴冷却的固定液，用新的、无油污锋利的（双面）刀片将材料切成大约1mm宽，2～3mm长的小块，从中挑选损伤小的小条，再将其切成１mm3的小块，最后用牙签将这些小块逐一放入盛有冷的新鲜固定液的有盖青霉素小瓶里，放入冰箱冷藏室低温固定（０～４℃）。 B．体外培养细胞的取材： 生长在培养瓶中的体外培养细胞取材时，先倒出培养液，接着倒入适量的戊二醛固定液，在冰浴上放置３～５min，然后用刮刀轻轻刮下瓶壁上的细胞，将含有细胞的固定液转移到离心管中，普通离心机低速离心（2000转/分钟）15min，使细胞聚成团块，弃去上清夜，换上新鲜固定液继续固定。 C．植物组织的取材： 植物材料的取材宜切成薄片状，经适当固定后再切成小方块。 （二）固 定 1.固定的概念： 用化学固定剂或冰冻、干燥及高温等物理方法迅速杀死细胞、以保持细胞形态结构不变的过程叫固定。固定的目的是尽可能使细胞中的各种细胞器及大分子保持生活状态的结构，并且牢固地固定在它们原来所在的位置上。经过良好固定的细胞器和大分子，不会由于一系列后继的处理而发生移位或丢失。 固定方法有化学固定法及物理固定法两大类，其中常用的是化学固定法。 2.几种常用的固定剂： 理想的固定剂应具有下列条件： A．能迅速而又均匀地渗入组织细胞内，并尽快杀死细胞以减少“死后变化”； B．能稳定细胞的各种结构成分，使之在脱水、渗透等过程中不溶解或损失； C．细胞结构形态不收缩或膨胀，无人工假象或变形； D．能保存酶的活性，以供电镜的细胞化学测定。 实践中较理想的固定剂有四氧化锇（锇酸）和戊二醛两种。其它还有高锰酸钾、多聚甲醛等。 ① 四氧化锇 通称锇酸。是一种淡黄色具有强烈刺激味的有毒晶体。其分子式为OsO4，水溶液是中性的。四氧化锇是一种强氧化剂，具有极大的毒性，操作时必须十分小心。固定时间约为2小时，如时间太长，使蛋白复合体溶解，使组织块发脆，造成切片困难。 ② 戊二醛 1963年开始采用，是现今广泛应用于电镜上的良好固定剂，对细胞内结构有良好的固定作用。常用它作为预固定剂，浓度通常为1.5－5％，时间一般为2小时。 ③高锰酸钾 一种强氧化剂，对磷脂蛋白类有特别良好的固定作用，可用于保护细胞膜、内质网膜、线粒体外膜等，尤其对神经髓脂质的固定效果更为显著，目前使用较少。 ④甲醛 其水溶液俗称福尔马林，甲醛的反应速率比戊二醛慢，对细胞精细结构的保存也不如戊二醛，但在酶活性的保存上却优于戊二醛，故甲醛一般多用于组织化学或快速固定。 固定方式 ①常规组织块的二次固定法 这种方法适合于大多数组织的浸泡固定。 A：预固定用2.5％戊二醛磷酸缓液冲液或二甲胂酸钠缓冲液或用2％多聚甲醛加2.5％戊二醛在4℃下固定1－2小时，固定液用量不少于组织体积的40倍。 B：在4℃下用缓冲液洗涤，必须彻底洗去残余的戊二醛，时间