高通量测序分析的几个方楼面及设计的生物信息技术.docxVIP

染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）也称结合位点分析法，是研究体内蛋白质与DNA相互作用的有力工具，通常用于转录因子结合位点或组蛋白特异性修饰位点的研究。将ChIP与第二代测序技术相结合的ChIP-Seq技术，能够高效地在全基因组范围内检测与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段。 ChIP-Seq的原理是：首先通过染色质免疫共沉淀技术（ChIP）特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，并对其进行纯化与文库构建；然后对富集得到的DNA片段进行高通量测序。研究人员通过将获得的数百万条序列标签精确定位到基因组上，从而获得全基因组范围内与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段信息。 技术路线 实验流程 生物信息分析流程 研究内容 测序 　　对客户提供的ChIP样品（如果有阴阳参启动子区域或DNA序列的）进行定量检测，检测合格后进行测序文库构建、DNA成簇（Cluster generation）扩增、高通量测序。 基本数据分析 　　数据产出统计：对测序结果进行图像识别（Base calling），去除污染及接头序列；统计结果包括：测定的序列（Reads）长度、Reads数量、数据产量。 高级数据分析 　　标准高级数据分析内容包括： 　　（1）ChIP-Seq序列与参考序列比对； 　　（2）Peak calling：统计样品Peak信息（峰检测及计数、平均峰长度、峰长中位数）； 　　（3）统计样品Uniquely mapped reads在基因上、基因间区的分布情况及覆盖深度； 　　（4）给出每个样品Peak关联基因列表及GO功能注释； （5）在多个样品间，对与Peak关联基因做差异分析。 转录组基因分析：RNA-seq RNA-seq即转录组测序技术，就是把mRNA,smallRNA,and NONcoding RNA等或者其中一些用高通量测序技术把它们的序列测出来。反映出它们的表达水平。 转录组是某个物种或者特定细胞类型产生的所有转录本的集合。转录组研究能够从整体水平研究基因功能以及基因结构，揭示特定生物学过程以及疾病发生过程中的分子机理，已广泛应用于基础研究、临床诊断和药物研发等领域。基于Illumina高通量测序平台的转录组测序技术使能够在单核苷酸水平对任意物种的整体转录活动进行检测，在分析转录本的结构和表达水平的同时，还能发现未知转录本和稀有转录本，精确地识别可变剪切位点以及cSNP（编码序列单核苷酸多态性），提供最全面的转录组信息。相对于传统的芯片杂交平台，转录组测序无需预先针对已知序列设计探针，即可对任意物种的整体转录活动进行检测，提供更精确的数字化信号，更高的检测通量以及更广泛的检测范围，是目前深入研究转录组复杂性的强大工具。 　　技术优势： 　　?? 数字化信号：直接测定每个转录本片段序列，单核苷酸分辨率的精确度，同时不存在传统微阵列杂交的荧光模拟信号带来的交叉反应和背景噪音问题。 　　?? 高灵敏度：能够检测到细胞中少至几个拷贝的稀有转录本。 　　?? 任意物种的全基因组分析：无需预先设计特异性探针，因此无需了解物种基因信息，能够直接对任何物种进行转录组分析。同时能够检测未知基因，发现新的转录本，并精确地识别可变剪切位点及cSNP，UTR区域。 　　?? 更广的检测范围：高于6个数量级的动态检测范围，能够同时鉴定和定量稀有转录本和正常转录本。 应用领域：转录本结构研究（基因边界鉴定、可变剪切研究等），转录本变异研究（如基因融合、编码区SNP研究），非编码区域功能研究（Non-coding RNA研究、microRNA前体研究等），基因表达水平研究以及全新转录本发现。 目前一些国内外转录组数据分析包括以下几个方面：武汉生命之美公司： t-s:转录组高通量测序（transcriptome sequencing,即RNA-seq） t-BA: 转录组数据基础分析（transciptome sequencingdata Basic Analysis） 流程： Pretreatment（有效序列Reads提取） 高通量测序质量评估，获得测序有效读长。 剔除每条序列中的index序列和adaptor序列。 获得有效序列总数。 Mapping (全基因组定位)：可“看见”自己样品中mRNA和ncRNA的分布状态。 Reads mapping: total mapped, unique mapped, multiple mapped. Genomic distribution of the mapped reads。包括基因不同区域分布分析： (1) 5’UTR，CDS，3’UTR，intron and intergenic region (2)