GB/T 19915.3-2005猪链球菌2型PCR定型检测技术.pdf

ICS07.100.30 一 一 C53 黝羚 中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准 GB/T19915.3-2005 猪链球菌2型PCR定型检测技术 MethodfordetectionStreptococcussuistype2byPCR 2005-09-27发布 2005-11-01实施 率替冒瞥臀瓣瞥篷臀臀暴发“ GB/T19915.3-2005 前 言 猪链球菌病是链球菌属中猪源链球菌引致的猪链球菌病的总称，其病原主要有猪链球菌2型和马 链球菌兽疫亚种。猪链球菌2型可引起猪败血症、脑膜炎等。人可通过伤 口感染该菌，并导致死亡。为 控制和预防该菌引致的猪链球菌病，建立快速、特异、敏感的检测方法是当务之急。本标准是采用公认 的细菌学诊断的现代分子生物学技术制定的。 本标准的附录A是规范性附录。 本标准由农业部畜牧兽医局提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：南京农业大学。 本标准主要起草人：陆承平、范红结、姚火春、何孔旺。 GB/T19915.3-2005 猪链球菌2型PCR定型检测技术 1 范围 本标准规定了猪链球菌2型的PCR的定型方法。 本标准适用于由猪链球菌2型引致的病死猪分离菌的检测和定型。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单 不（包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注 日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6682-1992 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 猪链球菌2型 Streptococcussuistype2 猪链球菌是属于链球菌属的一种细菌，根据其英膜多糖抗原的差异，可分为 1-34及 1/2共35个 血清型。猪链球菌2型是猪链球菌的一个血清型，不仅对猪致病性很强，而且可以感染特定的人群，是 一种重要的人畜共患病病原菌。 4 测定方法 4.1 方法提要 挑取可疑细菌培养物菌落加人PCR反应管中，进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，与 标准分子量标记比较，确定扩增产物的大小。 4.2 试剂和材料 除另有规定，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682-1992的灭菌双蒸水。 4.2.1猪链球菌2型定型PCR反应混合物和猪链球菌2型定型套式PCR反应混合物。 4.2.2 TaqDNA聚合酶。 4.2.3 琼脂糖：电泳级。 4.2.4 澳化乙锭。 4.2.5 分子量标记：DL-2000. 4.2.6 TE缓冲液：10mmol/LTris-HCI(pH8.0),lmmol/LEDTA(pH8.0). 4.2.7 10XPCR缓冲液：100mmol/LKC1,160mmol/L(NHe)2SOa,20mmol/LMgS04，200mmol/L Tris-HCI(pH8.8)，1％TritonX-100，1mg/mLBSA, 4.2.8 电泳缓冲液：242gTris碱，57.1mL冰乙酸，100mL0.5mol/LEDTA(pH8.0)，加蒸馏水至 1000mL，使用时10倍稀释。 4.2.9 加样缓冲液：0.2500澳酚蓝，40％蔗糖。 4.2.10 英膜基因PCR引物和英膜基因套式PCR引物。 4.2.11 阳性对照和阴性对照。 GB/T19915.3-2005 4.3 仪器和设备 4.3.1 离心