基因工身程载体.pptVIP

载体类型 存在方式 所需DNA序列 标记基因 转化频率（菌落/μgDNA） 稳定性 无丝分裂 有丝分裂 整合型(YIp5) 整合1-几个拷贝 与染色体DNA同源 Apr Tcr URA3 10 +a +a 附加体型(YEp13) 自主复制多拷贝 2μ质粒 Apr Tcr LEU2 103-104 -b -c 复制型(YRp7) 自主复制多拷贝 ARS Apr Tcr TRP1 103-104 -b -c 着丝粒型(YCp19) 染色体状通常单拷贝 ARS,CEN Apr TRP1,URA3 103-104 +d +d 线型(YLp21) 染色体状通常单拷贝 ARS、CEN、TEL TRP1，HIS3 103-104 +e + 酿酒酵母各种人工染色体载体的特征 a. 每次细胞分裂仍有约1%的载体DNA从染色体上脱落下来 b. 在选择培养基中15-20代后，10-30%的转化子丢失载体DNA c. 非孟德尔式分离，主要是4+：0- d. 无丝分裂时有3-14%转化体丢失质粒，有丝分裂时有3%转化体质粒不发生分离 在选择培养基上丢失质粒的转化体低于1% 第四节?动物病毒载体 质粒和噬菌体载体只能在细菌中繁殖，不能满足真核DNA重组需要。感染动物的病毒可改造用作动物细胞的载体。由于动物细胞的培养和操作较复杂、花费也较多，因而病毒载体构建时一般都把细菌质粒复制起始序列放置其中。使载体及其携带的外来序列能方便地在细菌中繁殖和克隆，然后再引入真核细胞。目前病毒载体常用者有改造来自猴肾病毒SV40（Simian Virus 40）、逆转录病毒和昆虫杆状病毒等，使用这些病毒载体的目的多为将目的基因或序列放入动物细胞中表达或作基因治疗等。 一、反转录病毒载体 属于正链RNA病毒，显著的特点是具有2倍体基因组。两个相同的RNA分子在5’端附近经氢键连接形成70S RNA，这种结构可能在逆转录过程中起调节作用。 反转录病毒的基因组结构 类似于真核细胞mRNA。 LTR是长末端重复序列。在病毒基因组整合中至关重要。整合时，整合酶在U5-U3连接处切开双链DNA，随机插入到宿主基因组里。LTR本身还具有启动子和polyA加尾信号的功能。 U5、U3：5’段或3’端独特序列。 y+：组装时必需的非编码序列。 env：外壳蛋白。 pol：反转录酶和整合酶。 gag：核心蛋白。 （三）反转录病毒载体构建 （1）删除pol、env和gag基因。 （2）插入标记基因（如neor） （3）外源基因和启动子插入到y+下游。 （四）反转录病毒载体的包装 （1）包装细胞系的构建 ??? 反转录病毒DNA转化细胞的效率很低，必须包装成病毒颗粒转染细胞。用两个缺失了y+的反转录病毒染色体转化细胞，以制造病毒外壳蛋白。 （2）载体RNA的包装 ??? 用载体DNA转化包装细胞系。转入的载体DNA上带有y+，转录成的载体RNA就会被包装细胞中原有的病毒外壳蛋白识别包装成重组病毒颗粒。 （五）反转录病毒载体的优点 （1）将DNA插入宿主基因组的随机位点上。 （2）侵染范围广、感染率高。 （3）整合的原病毒在宿主基因中比较稳定， 拷贝数目较低。 （4）包装的外源DNA可达10kb。 （5）反转录病毒感染哺乳动物细胞，对宿主细胞没有毒性。（反转录病毒一般只感染处在分裂状态的细胞） DNA病毒载体—腺病毒载体 （一）腺病毒的基因组：是线状双链DNA病毒，基因组中有14个基因。共同特点是都带有倒置的末端重复（ITR），在病毒的复制过程中起非常重要的作用。 （二）腺病毒的优点： （1）比较安全，无致病、致癌、致畸作用。 （2）宿主范围广：不仅能感染有分裂能力的细胞，也能感染不能分裂的细胞。 （3）可以在呼吸道和肠道中繁殖，可以通过口服或喷雾的方式感染。 （4）载体中的插入片断可达7.5kb （有包装容量限制）。 （5）腺病毒容易制备、纯化。 （6）基因组结构和功能了解得清楚。 （三）腺病毒载体 目前最常用的基因治疗载体之一。 腺病毒载体的构建:用同源重组的方法插入外源基因。 （1）删除腺病毒DNA一些非必需区。如E1或E3区，增加插入能力。 （2）构建质粒载体。含有E1或E3区两侧的同源序列，并在同源序列之间插入外源基因和选择标记基因。 （3）把质粒切成线性 （4）共同转染细胞。 在细胞中发生同源重组，把外源DNA加到病毒基因组中，并包装成重组病毒颗粒。 （四）重组腺病毒DNA在细胞中的生存 （1）以游离的附加体形式存在于细胞中。不能整合到细胞基因组中。基因表达时间短。 （2）E1是腺病毒繁殖的必需区。缺失E1的重组腺病毒必须在已经被腺病毒（辅助病毒）感染的细胞中繁殖。 （3）E3区对腺病毒的繁殖不是必需的。缺失E3的重组腺病毒不需要辅助