细胞核分离与纯化及RNADNA定量测定20121201.pptVIP

* * * 喻娟娟 生物化学与分子生物学教研室 联系电话: Email: yujuan8186@ 细胞核的分离纯化 及RNA、DNA的定量测定 实验六 1. 了解细胞核分离纯化的基本原理和方法 2. 掌握DNA、RNA定量测定的原理及方法 3. 掌握离心机的使用 一、细胞核的分离与纯化（上午） 二、RNA的定量测定 三、DNA的定量测定  （下午） 一、细胞核的分离与纯化 DNA、RNA在细胞中的分布： DNA 胞核内(98%) 胞质内(2%) RNA 胞核内(10%) 胞质内(90%) 核酸的种类： DNA、RNA 结论：DNA主要存在于细胞核， RNA主要存在于细胞质。 二、核酸的种类及其分布 核 酸 核苷酸 磷 酸 碱 基 戊 糖 定糖法（戊糖的差异） 三、核酸的鉴定 浓HCl ＋ 3H2O + β－ D－核糖 糠醛 　 糠醛 　 3，5－二羟基甲苯　 绿色化合物 RNA　　　　　　　　　　　　 ＯＨˉ　　　　　　　　　　　　 水解　　　　　　　　　　　　 β－ D－核糖 + Pi + A.G.C.U 地衣酚法: （1）核糖核酸RNA的测定 DNA Ｈ＋　　　　　　　　　　　　 水解　　　　　　　　　　　　 β－D－２－脱氧核糖 + Pi + A.G.C.U -H2O 硫酸 　脱氧核糖 ω －羟基－γ－酮基戊醛 蓝色化合物 二苯胺法: （2）脱氧核糖核酸DNA的测定 1、0.25mol/L蔗糖柠檬酸（含3.3 mmol/L CaCl2）称取蔗糖86g及CaCl2363mg，用1.5％拧檬酸液溶解并稀释至1000ml。 2、0.88mol/L蔗糖柠檬酸液（含3.3mmol/LCaCl2）称取蔗糖301g及CaCl2363mg，用1.5％柠檬酸液溶解并稀释至1000ml。 3、核洗液：即0.05mol/L，Tris—HCl（pH7.5）－0.15mol/L NaCl液。 在0.2mol/L Tris—HCl pH7.5缓冲液250ml中加NaCl8.7g再用蒸馏水稀释至1000ml。 4、 1.5％拧檬酸 5、0.9％NaCl 6、0.02N NaOH 7、离心机 8、水浴箱 9、常规玻璃仪器 试剂与器材 用颈椎脱臼法杀死小白鼠后，迅速剖开腹部取出肝脏，除去结缔组织，尽快置于盛有0.9%NaCl的小烧杯中，反复洗涤，尽量除去血液。洗完后将肝脏一分为二，每个小组半个肝，直接将半个肝放在小烧杯里剪碎，剪碎的肝脏放入匀浆器中，加入 1.5％柠檬酸钠溶液4.5ml，反复研磨制成匀浆，从而破碎细胞。研磨完后，将匀浆液用单层纱布进行过滤，以除去未研碎的组织。 （1）肝细胞匀浆的制备 （2）分离细胞质和细胞核 将过滤好的匀浆液，放入普通离心机，以3500r/min的转速，离心15min。缓慢倒出上清液（细胞质），移入另一试管中，保留待测定核酸时使用。 余下的沉淀物为粗制的细胞核，加入0.25mol/L蔗糖-拧檬酸溶液1ml ，用玻捧搅匀，制成细胞核悬液。 另取离心管一支，先加入0.88mol/L蔗糖-柠檬酸液9ml，用滴管吸取上述核悬液，沿管壁缓缓铺于0.88mol/L蔗糖-柠檬酸溶液液面上，再以2000r/min转速离心10分钟，倾去上层液，将管倒立于滤纸上，以吸干余液。沉淀为初步纯化的细胞核。 加入Tris－HCl－NaCl核洗液5ml洗涤沉淀，以2000r/min离心10min，除去上层液。得到的白色沉淀即为纯化的肝细胞核。 加5ml 0.02mol/L的NaOH使细胞核溶解为核液，保留，待测定核酸。 0.88 mol/L蔗糖-柠檬酸溶液9ml 核悬液 0.25 mol/L 0.88 mol/L 初步纯化的细胞核 其它的亚细胞结构 半个肝脏＋1.5%柠檬酸溶液4.5ml，制成匀浆 单层纱布过滤1次 滤液 离心：3500r/min；15min 上清液 （保留！） 沉淀 加入0.25mol/L 蔗糖柠檬酸溶液1ml 核悬液 沿壁缓铺于9ml 0.88mol/L蔗糖柠檬酸液面上 离心：2000r/min；10min 上清液（弃去） 沉淀 核洗液5ml洗涤沉淀 上层液（弃去） 沉 淀 纯化的细胞核 5ml 0.02mol/L NaOH溶解细胞核 待测样品 鉴定 离心：2000r/min，10min 细胞核的分离与纯化实验流程 试剂（ml） 1 2 细胞质液 1.0 - 细胞核液 - 1.0 1mol/LKOH 1