实验一：蛋白质的电离及等电点测定.pptVIP

实验一蛋白质两性电离与等电点 【教学目标】 1、独立操作，一丝不苟地作实验。 2、仔细观察不同阶段试剂颜色变化及沉淀的出现和消失，通过现象观察能分析蛋白质两性电离的性质，正确填写实验报告。 3、通过往五支不同pH值溶液的试管内加入酪蛋白，观察沉淀出现的情况，确定其等电点。 4、共同讨论测定等电点的原理。 一、蛋白质的两性电离 多肽链中氨基酸残基中有可解离基团，如：末端-COO-、-NH3+，酸性氨基酸侧链- COO- ，Lys的ε-NH3+，Arg的胍基，His的咪唑基。 *蛋白质的等电点(pI) 当蛋白质溶液处于兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。 NH3+ NH3+ NH2 P P P COOH COO-- COO- 正离子 兼性离子 负离子 pH＜pI pH=pI pH＞pI +OH- +OH- +H+ +H+ 各种蛋白质的氨基酸组成不同，解离情况不同，等电点不同。多数接近5.0。 蛋白质的性质之一：两性电离与等电点 【实验原理】 蛋白质分子是两性电解质。蛋白质在溶液的pH值为等电点时游离为两性离子，溶解度最低，容易沉淀析出。若在大于或小于等电点的溶液中，因蛋白质分子带有同种电荷而相互排斥，不易产生沉淀。 【试剂】 1、0.5％酪蛋白醋酸钠 2、0.01％溴甲酚绿指示剂 变色范围是pH3.8～5.4。指示剂的酸色型为黄色，碱色型为蓝色。 3、0.02mol／L盐酸溶液 4、0.02mol／L氢氧化钠溶液 5、1.00mol／L乙酸溶液 6、0.10mol／L乙酸溶液 7、0.01mol／L乙酸溶液 【操作】 1、蛋白质的两性电离 （1）取一支试管，加入0.5％酪蛋白醋酸钠溶液20滴和0.01％溴甲酚绿指示剂2滴，摇匀。观察溶液颜色，记录，并分析原因。 （2）用细滴管缓慢加入0.02mol/L盐酸溶液，、边滴边摇，直至有明显的大量沉淀发生，此时溶液的pH值接近酪蛋白的等电点。观察溶液颜色的变化，记录，分析原因。 （3）继续滴入0.02mol／L盐酸溶液，观察沉淀和溶液颜色的变化，记录，分析原因。 （4）再滴入0.02mol／L氢氧化钠溶液进行中和，观察是否出现沉淀，记录，解释原因。当继续滴入0.02mol／L氢氧化钠溶液时，观察沉淀和溶液颜色的变化。解释其原因。作好记录。 结果及分析 操作 实验结果 简要分析 在酪蛋白溶液中加入 指示剂 滴入HCL至出现大量 沉淀 继续滴入HCL 滴入NaOH溶液 继续滴入NaOH溶液 至沉淀溶解 2、酪蛋白等电点的测定 （1）取5支试管，编号后按下表的顺序准确地加入各种试剂，．然后混合均匀(每管加入酪蛋白醋酸钠溶液后，须立即摇匀该管)。 试剂(ml)及管号 1 2 3 4 5 蒸馏水（ml) 1.6 _ 3.0 1.5 3.4 0.01mol/L醋酸溶液 _ _ _ 2.5 0.6 0.10mol/L醋酸溶液 _ 4.0 1.0 _ _ 1.0mol/L醋酸溶液 2.4 _ _ _ _ 酪蛋白醋酸钠溶液 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 溶液的最终pH 3.2 4.1 4.7 5.3 5.9 沉淀出现的多少 (2)静置约20 min，观察每支试管中溶液的混浊度，以-，+，++，+++，++++符号表示沉淀的多少，将结果记录于上表中。 （3）该实验要求各种试剂的浓度和加入量必须相当准确。除了需要精心配制试剂以外，实验中应严格按照定量分析的操作进行。 思考题 根据实验观察结果，指出哪一支试管的pH是酪蛋白的等电点？在等电点时蛋白质的溶解度为什么最低？请结合你的实验结果和蛋白质的胶体性质加以说明。