动物伦理审查申请表-华东师范大学.DOC

PAGE \* MERGEFORMAT 3 2014年3月 华东师范大学动物实验伦理委员会 动物实验伦理审查表 登记编号 审查编号：x0001 该表必须打印，并须送至伦理委员会。如在填写过程中有任何疑问，请致54345245。 协议/研究题目 实验小鼠胚胎玻璃化冷冻液的筛选 主要研究者 马雪云 学位/职称 博士/高级工程师 地址： 上海市东川路500号 Email:xyma@ 工作单位 华东师范大学生命医学研究所 电话 #:021合作研究者 李玉宏 Email:sue1987031@163.com 导师 （如果主要研究者为学生） 学位/职称 工作单位 Email : 地址 电话 #: 项目起讫时间 2013年6月30日至2013年12月30日 项目资金来源 (请提供资金来源的影印件) 研究目的(阐明动物实验的必要性) 由于基基因敲除和转基因技术的快速发展，许多小鼠的人类疾病模型已成功建立，如各种遗传疾病，白内障、肥胖等疾病模型。常规繁殖方法维持这些特殊品系的小鼠，不仅需要大量的饲养空间、人工成本和其他经费，在保存过程中还有可能发生遗传变异、漂移、遗传污染和疾病传播等风险。通过冷冻保存小鼠胚胎建立冷冻胚胎库，不但避免的上述风险，有利于小鼠资源的保存，而且便于运输，有利于进行地区及国际间的交流。 常用的冷冻保护剂为乙二醇、丙二醇等小分子化合物，同时加入蔗糖、海藻糖等大分子化合物以维持冷冻过程中胚胎细胞内外的渗透压平衡。由于不同的冷冻保护剂对早期胚胎的冷冻效果存在一定的差异，本实验对不同冷冻剂的冷冻效果进行研究，为动物中心实验动物胚胎资源的冷冻保存提供冷冻剂的选择依据。 研究过程与方案 动物品种品系 BALB/C 动物规格（周龄/体重） 6-8周 动物性别、数量 40只雄 40只雌 动物微生物学级别 SPF 实验研究方案（亦可使用示意图） 1、配置不同的玻璃化冷冻液1、2、3 2、对雌鼠进行超排处理后与雄鼠合笼 3、收集胚胎，并进行胚胎评定 4、使用不同的冷冻剂冷冻胚胎 5、复苏胚胎 6、根据复苏胚胎的发育情况，评定冷冻剂的冷冻效果 实验动物分组处理情况 将获得的2-细胞胚胎分成3组，每组数量不低于100枚，分别记为A、B、C组 A组胚胎使用冷冻液1进行冷冻 B组胚胎使用冷冻液2进行冷冻 C组胚胎使用冷冻液3进行冷冻 详细实验过程（同时指出实验过程中减轻动物痛苦的措施） 1 胚胎的获取 取6-8周的雌性BALB/c小鼠，腹腔注射孕马血清（PMSG，宁波第二激素厂）7.5IU/只，48小时后注射人绒毛膜促性腺激素（hCG，宁波第二激素厂）7.5IU/只，注射后与雄性小鼠1:1同笼交配，次日上午检查雌鼠阴栓以确定是否交配成功。将交配成功的雌鼠进行颈椎脱臼处死，摘除输卵管，放入含有0.1%透明质酸酶（Hyaluronidase，SIGMA）的PBS中，在实体显微镜或解剖镜下用眼科镊子撕破输卵管膨大部，可见胚胎与颗粒细胞自动排出，3-5分钟之后待透明质酸酶将颗粒细胞脱除，收集形态正常的胚胎于M2中洗净，移入事先预热的KSOM培养小滴中37℃，5%CO2培养24小时备用。 2 冷冻方法 将0.25mL普通冷冻麦管（France）加热变软，双手牵拉两端，使其内径降为0.8mm，管壁厚度降为0.07mm，待麦管冷却变硬后，用刀片在麦管中间最细处切断，即为OPS。冷冻前将各种溶液及实验用器具在室温下平衡2h左右。选取培养24h后形态正常、大小均匀的2-细胞胚胎。取10枚左右胚胎用取卵针移入M2液滴中洗一下，然后移入冷冻液滴中，可以发现胚胎皱缩并漂浮在液滴表面，收集胚胎至另一冷冻液小液滴中，将OPS细的端口垂直接触含胚胎的小液滴（1~2μL），利用虹吸效应将胚胎和冷冻液吸入OPS，然后直接投入液氮中保存。胚胎接触冷冻液的时间控制在60~90s内。 3 解冻方法 用镊子把OPS从液氮中取出，将细的一端直接浸入37℃恒温台上0.5mol/L的蔗糖溶液中，1~2s内冷冻液融化，将胚胎轻轻吹出，在显微镜下立即将回收的胚胎移入新鲜的0.5mol/L蔗糖溶液平衡2min后，移入0.25mol/L蔗糖溶液中平衡2min，再移入0.125mol/L蔗糖溶液中平衡5min以脱出抗冷冻保护剂，同时记录回收胚胎数量。之后将胚胎用M2或PB1洗2~3次。移入事先预热的培养小滴中37℃，5%CO2培养。 4 胚胎体外培养： 将2.2.3得到的胚胎移入事先预热的KSOM培养小滴中37℃，5%CO2培养。每个培养小滴为50μl左右，每滴