双向电泳原理流及实验步骤.pptVIP

蛋白质组分析的首要要求 将来自于全细胞、组织或生物体中所包含的多达几千种混合蛋白质进行分离、检测和分析 。 2-DE技术依然是大多数蛋白质组研究中分离复杂蛋白质混合物的首选技术 。 一、双向电泳的实验原理 一维固相pH梯度等电聚焦（IEF with IPG）： IPG胶的材料是Immobilines，为拥有CH2=CH-CO-NH-R结构的8种丙烯酰胺衍生物系列，其中R包含羧基或叔氨基团，它们构成了分布在pH3-10不同值的缓冲体系。根据公布的配方计算后，将适宜的IPG试剂添加至混合物中用于凝胶聚合，在聚合中缓冲基团通过乙烯键共价聚合至聚丙烯酰胺骨架中而形成pH梯度。通过这种方式生成的IPG不会发生电渗透作用，因而可以进行特别稳定的IEF分离达到真正的平衡状态。 样品制备基本原则 使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白），制备方法应具有可重现性。 防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。 防止在样品制备过程中发生样品抽提后的化学修饰（如酶性或化学性降解等）。 完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。 尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性。 样品制备 细胞样品：反复冻融、超声破碎 组织样品：碾磨、匀浆 植物样品：碾磨 双向电泳样品的溶解 是成功进行双向电泳的最关键因素之一 溶解的目标： 样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体完全破