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第二章 蛋白质结构分析 第一节 蛋白质样品的准备 进行结构分析的蛋白质样品，一般要求纯度95％。这样的样品，通 常是用色谱和电泳精制过的。 一、SDS—PAGE纯化的样品 从SDS上分离的蛋白质必需经过特殊处理，使SDS浓度低于 0.0005％，否则SDS会影响到胰蛋白酶的酶解，也会大大降低HPLC分肽 时的分辨率。有报道指出，在2mol／L尿素存在下，用胰蛋白酶消化蛋白 质时，如果SDS浓度0.05％，则完全阻止了胰蛋白酶和内肽酶Lys-C的 作用。 虽然有报道用HPLC或用盐酸胍沉淀除去SDS，但不易掌握，尤其是共 价结合到蛋白质分子上的SDS分子更难除去。 在SDS后，采用电印迹(blotting)到PVDF膜上，也是常用的方 法，因为PVDF膜结合蛋白质能力的专一性远远超过其结合盐、氨基酸和 去垢剂，因此，蛋白质能和这些“污染物”分开。经过这样处理后，能用于 BrCN化学裂解或酶解。 二、HPLC纯化的样品 如果样品是用反相HPLC纯化的，因为流动相是挥发性溶剂，它们在 真空离心干燥或冻干样品时除去；如果蛋白质是用离子交换HPLC或疏水 HPLC或凝胶过滤HPLC精制的，则样品要进行脱盐。 脱盐或稀蛋白溶液的浓缩可用0.1％三氟乙酸(TFA)—乙腈(ACN)系统 的短柱反相HPLC；也可采用一次性的Sek-Pak，因为蛋白质是水溶性 的，所以先用能与水互溶的甲醇或乙腈(2ml)润之，再用5ml纯水洗 涤；然后样品液体通过Sep-Pak柱时，蛋白质保留在柱上，小分子的盐 类流过柱体，用水溶液充分洗涤后，最后用甲醇或乙腈抽提蛋白质。 小的超滤装置对浓缩蛋白质也是有效的。此外，有机溶剂或TCA沉淀 也可以考虑。 三、蛋白质样品中的二硫键和巯基(一SH) 当蛋白质样品纯度达到要求，盐和小分子也除得比较“干净”，在进行 酶解前，还要转变半胱氨酸残基成其他的稳定的衍生物。因为半胱氨酸 的巯基在分肽过程中易自动氧化成各种产物，包括形成无序的二硫键， 因此需要将半胱氨酸残基先转变成稳定的衍生物。 常用有碘代乙酸烷化，因为这个反应是快速和专一的；同时这类试剂 保存在暗处是很稳定的。而且，这类试剂的矫作物(artifact)容易得到放 射性标记物。蛋白质或肽在导入带电荷基团后也增加了其在水溶液中的 溶解度。胱氨酸也可在还原后再修饰。 1．还原和羧甲基化 将1 ～ 20mg蛋白质溶解在含6mol/L盐酸胍的0.1mol/LTris- 1mmol/LEDTA的缓冲液中，pH8.3，加DTT至2mmol/L或再多一些 (过量于存在于蛋白质中的二硫键)，通氮气，然后迅速封闭，37℃反应 1h，再加入50mmol/L的碘代乙酸(已用NaOH中和)，其量为1.1倍(分 子比)过量于溶液中的巯基数(蛋白质中的一SH和DTT中的一SH总和),典 型为4.5～5mmol/L，再次充氮气，于暗处37℃保温1h。加2—巯基乙 醇至最后浓度1％(V/V)结束反应，然后对50mmol/LNH4HC03，含 0.01％硫二甘醇(thiodiglyc01)充分透析，冻干。 注意：碘代乙酸必须是无色的，如果有碘存在，呈淡黄色，会引起巯 基迅速氧化，阻碍了烷化反应，而且可能有副反应，使色氨酸修饰。 碘代乙酰胺(iodoacetamide)也常代替碘代乙酸用于半胱氨酸残基的 烷化。这常用于避免牛胱氨酸被导入负电荷，而用中性的碘代乙酰胺。 另一种情况是变性剂不用盐酸胍，而用SDS，这时如果用碘代乙酸，反 应往往进行得很慢，而且不完全，这是因为碘代乙酸的负电荷和蛋白 质—SDS胶束(微团)上的负电荷相互排斥。 2．还原和吡啶乙烯化 用4—乙烯吡啶(4-vinylpyridine)处理同上，通氮气保温过夜。 第二节 蛋白质的化学裂解 裂解于甲硫氨酸(Met) 溴化氰(BrCN)是首选的化学试剂，专一裂解在甲硫氨酸的羧 基端，对多数蛋白质裂解效率为90％以上。BrCN在酸性条件下， 裂解在甲硫氨酸的C端肽键上，将甲硫氨酸转化成高丝氨酸 (Ⅱ)(homoserine)和高丝氨酸内酯(I)(homoserinelactone)的混合物， 它们之间也能相互转化，如图2.1所示。 对Met-Thr、Met-Ser键，则常常是低产率的，可能是β羟基产生下 面的一系列反应(Ⅲ和Ⅳ)，最后形成高丝氨酸残基(V)，而未裂解此肽 键，如图2.2所示。Met-Cys键也不易裂解。 典型的反应常常在20℃、70％甲酸(V/V)中进行24h， 副反应是部分Asp-Pro键会断裂，一些酰胺基团会部分丢 失，部分Asn-Gly会产生重排或环化，有时Trp会氧