307医院EGFR突变检测经验总结.ppt

注意事项：PCR扩增部分⑴ 1、DNA质量控制非常重要，可保证后续实验的顺利进行（模板过量、PCR抑制剂） 2、设置好阴性对照（避免污染）和阳性对照（验证实验体系，必要时可取消） 3、选用保真性较高的Taq酶，避免由实验体系带来的假阳性 4、做好详细的实验记录，为以后的各种分析提供依据（示例） Marker 百倍稀释 原液 空白 Marker 空白 19 21 Marker 空白 19 21 * * * * * * 307医院EGFR突变检测经验总结 开展EGFR突变检测面临的问题 一、是什么和为什么 二、怎么做及注意事项 三、临床问题的解决：转化性研究 一、是什么和为什么 EGFR基因的基本情况 EGFR：表皮生长因子受体 EGFR的胞内信号传导途径 EGFR与肿瘤的生长及酪氨酸激酶抑制剂（TKI） ——/ EGFR的突变与TKI类药物疗效 19外显子：5‘-TATCAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCGAAAG-3’ 21外显子：5‘-GGGCTGGCCAAACTG-3’ ——N Engl J Med 2004;350:2129-39 EGFR的突变类型 ——Nature Reviews Cancer 2007;7:169-181 肺癌靶向治疗的里程碑：IPASS研究 肺癌靶向治疗的里程碑：IPASS研究 ——N Engl J Med 2009;361:947-57 肺癌靶向治疗的里程碑：IPASS研究 EGFR突变状态指导TKI类药物的使用 EGFR突变状态已成为患者能否在一线使用TKI药物的重要指标 二、怎么做及注意事项 目前较为常见的RGFR突变检测方法 —— EGFR突变检测中需要明确的几个基本概念 2、基因突变是指DNA发生碱基序列的改变：须选择有针对性的检测手段，针对非DNA的检测手段如：RT-PCR（检测RNA表达），免疫组化（检测蛋白表达）以及针对非碱基序列的检测手段如：FISH（检测DNA的扩增、缺失、断裂、融合）等，均不适用。 体细胞突变 发生在非种系组织中 不具有遗传性 不会遗传给子代 种系突变 发生于精子或卵子中 可以遗传子代 子代所有细胞均带突变 1、EGFR突变为体细胞突变：发生于肿瘤细胞中，正常细胞（癌旁或白细胞等）不含突变。要尽可能取到足量的肿瘤细胞进行检测，这是保证检测结果可靠的根本前提。 肿瘤细胞内及与正常组织间的异质性 片段化的DNA不容易进行扩增 EGFR突变检测中需要明确的几个基本概念 3、样品特性：异质性，突变细胞或DNA的含量一般较少，DNA经常会严重片段化 4、关键是保证突变DNA有效扩增至可检测的范围：扩增效率及检测方法的敏感性 1、TapMan 探针法：边扩增边检测 优势 只检测突变的序列 敏感性高且污染几率小 不足 探针费用较高 只能针对已知突变 正常DNA的扩增无限制 Nature Reviews Drug Discovery 2004：3, 749-761 突变DNA 有荧光信号 野生型DNA 无荧光信号 特定的探针：只结合突变序列 2、高分辨率溶解曲线（HRM）：扩增后再检测 优势 已知和未知突变序列 敏感性高且污染几率小 不足 正常DNA的扩增无限制 对仪器设备的要求较高 阳性结果还需进一步确认 3、变性高效液相色谱分析（dHPLC）：扩增后再检测 优势 敏感性高 已知和未知突变序列 不足 仪器普及率低 正常DNA的扩增无限制 开盖检测增加污染几率 阳性结果还需进一步确认 检测环境需独立且通风良好 4、直接测序法：扩增后再检测 优势 直观且相对成本低 已知和未知突变序列 不足 工作量大且敏感性低 开盖会增加污染几率 正常DNA的扩增无限制 Sanger 测序法原理 5、焦磷酸测序：扩增后再检测 优势 适合已知序列 已知和未知突变均可测 敏感性高、直观、能够定量 不足 需要专用仪器 正常DNA的扩增无限制 开盖会导致污染几率增加 6、突变富集PCR：扩增后再检测（抑制正常DNA扩增） 优势 敏感性高（此消彼长） 不足 操作繁琐 只针对已知突变 开盖导致污染几率增加 不好找合适的限制性内切酶 ——Clin Cancer Res 2006;12(1):43-48 7、扩增阻滞突变系统（蝎形探针）：边扩增边检测 优势 敏感性高且污染几率小 只扩增并检测突变的序列 不足 只针对已知突变 试剂盒费用较高 72℃延伸 94℃解链 60℃自身杂交发光 ARMS引物 各种突变检测方法的综合比较 —— 1、操作流程 2、污染几率 3、敏 感 性 4、可实施性 我们最初采用的方法：直接测序法 选择的理由 结果直观易懂 大量文献支持、金标准 实验室条件能够满足要求 注意事项：DNA抽提部分 新鲜组织 体