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微生物菌种保藏的原理与方法 菌种保藏基本原则 保藏菌种时首先要选择它们的休眠体，如分生孢子、芽孢等，并创造一个低温、干燥、缺氧、避光和缺少营养的环境条件，以利于休眠体能较长时间维持其休眠状态。 对于不产孢子的微生物，也要使其新陈代谢处于最低水平，又不会死亡，从而达到长期保藏的目的。 常用菌种保藏方法 1 常用的简易保藏法： 斜面传代保藏法、半固体穿刺保藏法（适用于细菌和酵母菌）、石蜡油封法 2 甘油保藏法 3 干燥保藏法 4 真空冷冻干燥保藏法 5 液氮超低温保藏法 1 简易保藏法 基本原理：利用低温来抑制微生物生命活动。 通常将在斜面或半固体培养基上生长良好时培养物直接放到2~10 ℃冰箱中保藏，当培养基营养物质消耗殆尽后再重新移植到新的 培养基上，故又称定期移植保藏法或传代培养保藏法。 1 简易保藏法 定期移植时间间隔： 一般不产芽孢的细菌约2周至1个月； 放线菌、酵母菌和丝状真菌4~6个月； 石蜡油封法一般可保藏1年。 优缺点：操作简单，可随时观察菌种生长状况，但较费时费力，因经常移植传代，微生物物易发生变异。 1.1斜面传代保藏法 贴标签：菌种 菌株 接种日期 接种：对数生长期后期 成熟的孢子 培养： 细菌—37℃，18~24h 酵母—28~30 ℃ ，36~60h 放线菌和丝状真菌—28 ℃ ，4~7d 收藏：管口面塞用牛皮纸包扎，或用融化的固体石蜡封棉塞后置4冰箱保存。 1.2半固体穿刺保藏法 贴标签 穿刺接种：将菌种直刺入直立柱中央 培养：同传代保藏法 收藏：待菌长好后，用浸有石蜡的无菌软木塞或橡皮塞代替面塞并塞紧，置4 ℃冰箱中保藏，保藏0.5~1年。 1.3石蜡油封法 石蜡油灭菌：将石蜡油装入三角瓶中，装量不超过总体积的1/3，塞上面塞，外包牛皮纸，加压蒸汽灭菌（121 ℃ ，30min），连续灭菌2次。然后在40 ℃温箱中放置2周或置105~110 ℃烘箱中烘2h，除去石蜡油中的水分。 培养 加石蜡油：以无菌吸管吸石蜡油加至菌种管中，加入量以高出斜面顶端或直立柱培养基表面约1cm为宜。 收藏：面塞外包牛皮纸或用无菌橡皮塞，把菌种管直立放置于4 ℃冰箱中。 放线菌、霉菌及产芽孢细菌一般可保2年，酵母菌及不产芽孢细菌可保1年。 2 甘油保藏法 保护剂： 40%左右的甘油 机理：适当浓度甘油中，少量甘油分子进入细胞，使菌种细胞在冷冻过程中缓解了其由于强烈脱水及胞内形成冰晶而引起的破坏。 保藏温度：-20 ℃左右或-70 ℃ 特点:操作简单，保藏期长，保存期间取样测试方便，在基因工程中常用于保存含质粒的菌株，一般可保3~5年。 2 甘油保藏法 方法步骤： 无菌甘油的制备：80%的甘油在121℃灭菌20min 保藏培养物的制备：活化 纯化 性能检测 制备菌种培养物 保藏菌悬液的制备：液体法 菌苔法 -20 ℃保藏 快速冷冻；乙醇-干冰 液氮 超低温保藏：-70 ℃ 一般细菌、酵母保存期为3~5年。 3 干燥保藏法 基本原理：将微生物赖以生存的水分蒸发掉，使细胞处于休眠和代谢停滞状态，从而达到较长期保藏的目的。低温条件下，保藏期可达数年至十几年之久。 砂土管保藏法、明胶片保藏法、硅胶保藏法、麸皮保藏法 砂土管保藏法—产生芽孢的细菌及形成孢子的霉菌和放线菌。 方法：处理砂土 装沙土管 制备菌液 加孢子液 干燥 收藏 恢复培养 明胶片保藏法—细菌 制备菌悬液 制备菌液 制备蜡纸 加菌液 干燥 收藏 恢复培养 硅胶保藏法—丝状真菌。 方法：制备硅胶 制备菌液 加菌液 干燥 收藏 恢复培养 麸皮保藏法—产孢子的丝状真菌。 制备麸皮培养基 培养菌种 干燥 收藏 恢复培养 4冷冻真空干燥保藏法 该法集中了菌种保藏中低温、缺氧、干燥和添加保护剂等多种有利条件，是微生物代谢处于相对静止状态。 该法可同时用于细菌、放线菌、丝状真菌、（除少数不产孢子或只产生丝状体真菌外）、酵母菌及病毒的保藏。 该方法保藏菌种范围广、保藏时间长（一般可达10~20年），存活率高，是目前最有效的菌种保藏方法之一。 5液氮超低温保藏法 将菌种保藏在超低温（-196℃~-150 ℃ ）的液氮中，可降低变异率和长期保持原种的性状。 对于冷冻干燥保藏法或其他干燥保藏有困难的微生物，如支原体、衣原体及难以形成孢子的小霉小型藻类或原生动物都可用本法长期保存，这是当前保藏菌种最理想的方法。 保护剂：20%甘油或10%二甲基亚砜（DMSO） * * 3干燥保藏法 3干燥保藏法 4冷冻真空干燥保藏法 安瓿管