核酸提取、常见问题分析和解决方案.ppt

RNA降解 冷冻样品： 样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后可以移至-70℃冰箱保存。样品要相对小一点； 先用液氮研磨，再加裂解液匀浆； 样品与裂解液充分接触前避免融化，研磨用具必须预冷，碾磨过程中及时补充液氮。 OD260 /OD280 比值偏低 蛋白质污染： 不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。 减少起始样品量，确保裂解完全、彻底 解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。 苯酚残留： 不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。 解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。 OD260 /OD280 比值偏低 抽提试剂残留： 确保洗涤时要彻底悬浮 RNA，并且彻底去掉 75% 乙醇。 解决办法:再沉淀一次后，溶解。 设备限制： 测定OD260 及OD280 数值时，要使OD260 读数在 0.10 - 0.50 之间。此范围线性最好。 用水稀释样品： 测 OD 时，对照及样品稀释液请使用 10 mM Tris，pH 7.5。用水作为稀释液将导致比值的降低。 电泳带型异常 非变性电泳： 上样量超过 3ug，电压超过 6V/cm，电泳缓冲液陈旧，均可能导致 28S 和 18S 条带分不开。 变性电泳条带变淡： EB 与单链的结合能力要差一些，故同样的上样量，变性电泳比非变性电泳要淡一些； 甲醛的质量不高 。 下游实验效果不佳 RNA 降解 抽提试剂的残留 75% 乙醇洗涤 样品中杂质的残留 多糖等杂质，再次沉淀 DNA 污染 使用RNase-Free 的 DNase I 消化抽提RNA RT常见问题分析和解决方案 问题一：少量或没有RT-PCR产物 RNA降解 分离无污染，高质量的RNA；防止RNA降解 RNA中含逆转录酶抑制剂 70％（v/v）乙醇清洗RNA沉淀，除去抑制剂 起始RNA量太低 增加RNA的量 多糖同RNA共沉淀 用氯化锂沉淀RNA以除去多糖 合成cDNA第一链合成的引物退火失败 确定退火温度适合所用的引物 RNA模板存在较多二级结构 将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退火，提高逆转录反应温度 反转录成功，PCR失败 PCR步骤中使用超过1/5的逆转录反应产物 可能原因 解决方案 RT常见问题分析和解决方案 问题二：有非特异性带 引物和模板的非特异性退火 基因特异性引物设计较差 RNA中有基因组DNA的污染 形成引物二聚体 镁离子浓度太高 提高反应的温度和特异性 提高引物的特异性 使用扩增级DNaseⅠ处理RNA 设计在3端没有互补序列的引物 优化镁离子浓度 可能原因 解决方案 问题三：产生弥散（smear）条带 第一链产物的含量过高 PCR反应中引物过多 循环数过多 退火温度过低 寡核苷酸片段产生的非特异性扩增 常规PCR步骤中减少第一链产物的量 减少引物的用量 减少PCR的循环次数 提高退火温度 提取高质量RNA，防止被DNA污染 可能原因 解决方案 RT常见问题分析和解决方案 核酸提取及常见问题分析 　　　核酸是遗传信息的载体，包括DNA和RNA,是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因此核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作 。 前言 第一部分：DNA提取方法简介 第二部分：DNA提取常见问题、 　　　　　原因分析及其对策 内容 第三部分：RNA提取方法简介 第四部分：RNA提取及其RT-PCR常见 问题、原因分析及其对策 DNA提取的几种方法 　染色体DNA的提取 　CTAB法 　SDS法 　其它 DNA提取的几种方法 　非染色体DNA的提取 　质粒DNA的提取 碱裂解法 煮沸法　 　线粒体、叶绿体DNA的提取 差速离心结合SDS裂解法 基因组DNA－CTAB法 　CTAB法原理（植物DNA提取经典方法） CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。 该复合物在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。 SDS法原理 基因组DNA－SDS法 SDS(十二烷基硫酸钠)是一种阴离子去垢剂，在高温（55～65℃）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸； 提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀； 上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复