核酸内切酶的基本概念、作用特点及作用原理及其应用.ppt

DNA的限制性内切酶酶切分析 【实验目的】 1.掌握限制性核酸内切酶的基本概念、作用特点及作用原理 2.熟悉DNA的限制性内切酶酶切分析操作技术及其影响因素 3.了解DNA酶解技术生物研究领域的应用 【实验原理】 限制性内切酶(restriction endonuclease，RE)是一类能识别双链DNA分子中特定核苷酸顺序(一般具有双重对称的回文结构)，并以内切方式水解水解双链DNA的核酸水解酶 。 它主要分布于细菌体内，目前已发现1800多种。 根据酶的组成、辅助因子及水解DNA的方式不同，可将限制性内切酶分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三种类型. 限制性内切酶II的主要用途： ——基因克隆 ——基因测序 2、可将DNA切割形成： 5‘磷酸基末端 平端切口 3‘羟基末端 粘端切口 本实验选用EcoRⅠ(识别位点G↓AATTC)和 Pst I(CTGCA ↓ G)对质粒DNA进行酶切，经琼脂糖凝胶电泳后，在紫外扫描仪下摄影即可观察到质粒DNA的限制性酶切图谱。 琼脂糖凝胶电泳是分离、鉴定和纯化 DNA 片段的常规方法。 利用低浓度的荧光嵌入染料 - 溴化乙锭（EB）进行染色，可确定 DNA 在凝胶中的位置。 如有必要，还可以从凝胶中回收DNA条带，用于各种克隆操作。 琼脂糖凝胶的分辨能力要比聚丙烯酰胺凝胶低，但其分离范围较广。用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为200bp至近50kb的 DNA。长度100kb 或更大的DNA ，可以通过电场方向呈周期性变化的脉冲电场凝胶电泳进行分离。 在基因工程的常规操作中，琼脂糖凝胶电泳应用最为广泛。它通常采用水平电泳装置，在强度和方向恒定的电场下进行电泳。 DNA 分子在凝胶缓冲液（一般为碱性）中带负电荷，在电场中由负极向正极迁移。 DNA 分子迁移的速率受分子大小，构象。电场强度和方向、碱基组成、温度和嵌入染料等因素的影响。 【实验仪器及试剂】 一、器材 1.恒温水浴箱?????????????? 2. 电泳仪和水平电泳槽 3.紫外扫描分析仪 4.台式高速离心机 5.微波炉 6.加样枪、EP管及试管架等 二、试剂 1．DNA底物： ? 质粒DNA 2．限制性内切酶 EcoRⅠ及其缓冲液? 限制性内切酶 PstⅠ及其缓冲液 购自华美生物工程公司，每种限制性内切酶均配有2种缓冲液，在配套的缓冲液中该限制性内切酶均可获得100%酶切活性。 3．5×TBE 电泳缓冲液? 取Tris54g，硼酸27.5ml，0.5mol/L EDTA 20ml，加蒸馏水至1000ml。1×TBE为配制琼脂糖凝胶及其电泳的应用缓冲液。 4．溴酚蓝指示剂溶液(6×上样缓冲液)? 称取溴酚蓝100mg，加双蒸水5ml，在室温下过夜，待溶解后再称取蔗糖25g，加双蒸水溶解后移入溴酚蓝溶液中，摇匀后定容至50ml，加入NaOH 1滴，调至蓝色。 5．溴化乙锭(EB，1 mg/ml)? 戴手套谨慎称取EB 20mg于棕色试剂瓶中，加20ml双蒸水，溶解后贮于4℃备用，配制琼脂糖凝胶时每100ml凝胶加50μl EB。 6．DNA分子量标准? 根据需要购买，一般浓度为0.5μg/μl。 【实验步骤】 1．酶切混合液配制? 缓冲液2μl 质粒DNA (1μg) 1μl EcoRⅠ 1μl ( 10U) 双蒸水 7μl 混匀后稍离心，37℃水浴箱中反应1h。 2．琼脂糖凝胶制备? 称取0.8g琼脂糖倒入三角瓶中，加入1×TBE缓冲液100ml，置微波炉中加热至完全熔化并摇匀，稍冷却后加50μl EB染色液，摇匀。 3．灌胶 (1) 将内槽放置于一水平台面，并插好所需齿数和厚度的样品梳子。 (2) 将冷却至60℃左右的琼脂糖凝胶液，缓慢倒入内槽，直至所需厚度，注意不要形成气泡，特别是梳子下，如有气泡可挑破。 (4) 待胶凝固后，小心取出梳子，将带凝胶的内槽放入电泳槽中，凝胶点样端靠近负极。 (5) 加入1×TAE缓冲液至电泳槽中，使缓冲液淹过凝胶表面0.5 cm。 4．加样? 剪取适当大小的蜡膜(Parafilm膜)，取6×上样缓冲液1μl点于膜上数点。取5μl酶切DNA样品、0.5～1μg未酶切DNA、DNA分子量标准分别与上样缓冲液混匀，将其分别加入凝胶点样孔，记录点样顺序及点样量。 5．电泳?