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目的 掌握彗星电泳的原理 熟悉彗星电泳的操作方法 掌握彗星电泳的评价方法 原理 单细胞凝胶电泳(Single cell gel electrophoresis，SCGE)是由Ryberg B和Jonhanson K J首先提出后又经Singh N P和Olive P I进一步完善的一种在单细胞水平上检测DNA损伤与修复的方法。因其细胞电泳形状颇似彗星，又称彗星试验(comet assay)。它是一种测定和研究单个细胞DNA链断裂的新电泳技术，与传统方法相比，其简便、快速、灵敏、样品量少、无需放射性标记，具有极高的实用价值。目前该技术已广泛地应用于体内、体外各种有核细胞经受试物诱导的DNA损伤和修复的研究 。 步骤 γ射线照射细胞后，分别于照射后0h，30’，1h，2h，4h收集细胞并做细胞计数，以适量PBS重悬细胞； 胶片制备 取100 ul 用微波炉熔解的 1%正常熔点琼脂糖(NMA)滴在预热的(45℃~70℃)磨砂载玻片上，迅速盖上干净的盖玻片，4℃ 15分钟，(第一层) 将琼脂糖凝固后，取下盖玻片。将细胞悬液（约3000个cell/片）与180ul0.65%低熔点琼脂糖溶液在37℃混匀后，取一半液体滴在第一层的琼脂糖上（2个/载），盖上盖玻片，4℃，15min.( 第二层越薄越好，使细胞尽量在一个平面上) 取下盖玻片，在第二层上滴加60ul0.65%低熔点琼脂糖，4℃，15min。（第三层） 细胞裂解与电泳 将制好的胶板揭去盖玻片后，侵入4℃预冷的新配制的细胞裂解液中，4℃，2hr（溶解细胞膜及核膜，除去蛋白质、RNA等，仅存核骨架） 将载玻片置于0.5%TBE中，1hr更换一次，共2hr 将载玻片置于电泳槽中，加入0.5%TBE没过盖玻片，25V、8mA、4℃、25min. 取出载玻片，用吸水纸吸干 每片滴加60ulPI( 5ug/ml) 染色20min.用蒸馏水洗一下即可观察。 取出玻片放于无Ca2+、Mg2+的PBS中洗1-2次，吸水纸吸干； 每片载玻片上加60μl 2μg/ml PI染色15min，蒸馏水冲洗盖玻片观察并拍照（Olympus荧光显微镜绿色激发光下观察）； 用casp. exe软件分析细胞拖尾变化 思考题 彗星实验的原理？ 彗星实验的评价方法？ * * 彗星电泳检测辐射诱发DNA损伤
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