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基因敲除技术 同源重组法 插入突变法 RNAi法 * * 基因敲除技术介绍 基 因 敲 除 1.基因敲除简介 2.基因敲除方法及其原理 3.基因敲除应用 基因敲除简介 中文名称：基因敲除或基因剔除 英文名称：gene knock-out; gene knockout 定义1：将细胞基因组中某基因去除或使基因失去活性的技术。去除原核生物细胞、真核生物的生殖细胞、体细胞或干细胞基因组中的基因等。广义的基因敲除包括某个或某些基因的完全敲除、部分敲除、基因调控序列的敲除以及成段基因组序列的敲除。 所属学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；方法与技术（二级学科） 定义2：将细胞基因组中某基因去除或使基因失去活性的方法。敲除的基因用以观察生物或细胞的表型变化，是研究基因功能的重要手段。 所属学科：细胞生物学（一级学科）；细胞生物学技术（二级学科） 定义3：在基因组水平上改变或破坏靶基因的结构，使其功能完全丧失的实验技术。 所属学科：遗传学（一级学科）；发育遗传学（二级学科） 基因敲除简介 定义：通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。 1234567 123456790 8 90 基因敲除 基因敲除方法及其原理 通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和RNAi，它们同样可以达到基因敲除的目的。 利用基因同源重组进行基因敲除 利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤 （以小鼠为例） 7 a.基因载体的构建 把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因的载体上，成为重组载体。 b．ES 细胞的获得： 现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，最常用的是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也有使用。 ｃ.同源重组： 将重组载体通过一定的方式导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中，从而得以表达 ｄ．选择筛选已击中的细胞： 目前常用的方法是正负筛选法（PNS法），标记基因的特异位点表达法以及PCR法。其中应用最多的是PNS法。 ｅ．表型研究： 通过观察嵌和体小鼠的生物学形状的变化进而了解目的基因变化前后对小鼠的生物学形状的改变，达到研究目的基因的目的。 f．得到纯合体： 由于同源重组常常发生在一对染色体上中一条染色体中,所以如果要得到稳定遗传的纯合体基因敲除模型，需要进行至少两代遗传。 基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。 该方法通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因的目的，克服了随机整合的盲目性和偶然性，是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。 直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。 利用随机插入突变进行基因敲除  此法利用某些能随机插入基因序列的病毒，细菌或其他基因载体，在目标细胞基因组中进行随机插入突变，建立一个携带随机插入突变的细胞库，然后通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞。 基因捕获法是最近发展起来的利用随机插入突变进行基因敲除的新型方法 。 技术原理： 插入载体的选择： 根据细胞的不同，插入载体的选择也有所不同。 1)逆转率病毒可用于动植物细胞的插入； 2)植物细胞中农杆菌介导的T-DNA转化和转座子比较常用； 3）噬菌体可用于细菌基因敲除。 基因捕获法的优点  面对人类基因组计划产生出巨大的功能未知的遗传信息，传统的基因敲除方法显得有些力不从心。因此，基因捕获法应运而生，利用基因捕获可以建立一个携带随机插入突变的ES细胞库，节省大量筛选染色体组文库以及构建特异打靶载体的工作及费用，更有效迅速地进行小鼠染色体组的功能分析。  基因捕获法的缺点 只能剔除在Es 细胞中表达的基因。 用基因捕获法进行基因剔除的另一个缺点是无法对基因进行精细的遗传修饰。 RNAi引起的基因敲除 RNAi基因敲除的优点及应用  ①.比用同源重组法更加简便，周期大大缩短。  ②.对于哺乳动物，如对于一些敲除后小鼠在胚胎时就会死亡的基 因，可以在体外培养的细胞中利用RNAi技术研究它的功能。 ③.由于RNAi能高效特异的阻断基因的表达，它成为研究信号传导通路的良好工具。  ④.RNAi还被用来研究在发育过