淀粉酶的制备及活力测定..pptVIP

项目二 淀粉酶的制备及活力测定 姓名：张婉月 班级：生物制药1311 学号：2013040829 组别：第2组 指导老师：彭加平 韦平和 目录 背景知识 实训原理 实验材料及仪器 实训步骤 注意事项 参考文献 背景知识 淀粉是植物最主要的贮藏多糖，也是人和动物的重要食物和发酵工业的基本原料。淀粉经淀粉酶作用后生成葡萄糖、麦芽糖等小分子物质而被机体利用。 淀粉酶属于水解酶类，是催化淀粉、糖原、糊精中糖苷键水解的一类酶的统称。此类酶广泛存在于动植物和微生物中。根据对淀粉的作用方式不同，可将淀粉酶分为α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、脱支酶。 酶的活力是酶的重要参数，反映的是酶的催化能力，因此测定酶活力是研究酶的基础。 α -淀粉酶随机作用于直链淀粉和支链淀粉的直链部分α -1,4糖苷键，单独使用时最终生成寡聚葡萄糖、α-极限糊精和少量葡萄糖。Ca 2+能使α-淀粉酶活化和稳定，它比较耐热但不耐酸，pH 3.6 以下可使其钝化。 β-淀粉酶从非还原端作用于α-1,4糖苷键，遇到支链淀粉的α -1,6键时停止。单独作用时产物为麦芽糖和β-极限糊精。β-淀粉酶是一种巯基酶，不需要 Ca 2+ 及 Cl —等辅助因子，最适pH偏酸，与α -淀粉酶相反，它不耐热但觉耐酸，60 ℃保温15min可使其钝化。 α-淀粉酶活力测定常用的方法 α-淀粉酶的工业应用 焙烤工业 淀粉工业 啤酒酿造 酒精工业 纺织退浆 造纸 清洁剂 实训原理： 淀粉经淀粉酶作用后生成葡萄糖、麦芽糖等小分子物质从而被机体利用。淀粉酶主要包括α-淀粉酶和β-淀粉酶两种。α-淀粉酶可随机作用于淀粉中的α-1，4-糖苷键，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，同时使淀粉的黏度降低，因此又称为液化酶。β-淀粉酶可从淀粉的非还原末端进行水解，每次水解下一分子麦芽糖，又被称为糖化酶。 实训原理： 淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。用标准浓度的麦芽糖溶液制作标准曲线，用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。 淀粉酶存在于几乎所有植物中，特别是萌发后的禾谷类种子，淀粉酶活力最强，其中主要是α-淀粉酶和β-淀粉酶。两种淀粉酶特性不同，α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下迅速钝化。β-淀粉酶不耐热，在70℃15min钝化。 实验材料及仪器 1、材料 萌发的小麦（或稻谷）种子（芽长约1cm）。 2、仪器设备 分光光度计；离心机；恒温水浴（37℃，70℃，100℃）；具塞刻度试管；刻度吸管；100mL容量瓶2个；25mL比色管15支；试管8支；电子天平；研钵。 试剂及配制 （1）标准麦芽糖溶液（1mg/mL）：精确称取100mg麦芽糖，用蒸馏水溶解并定容至100mL； （2）3，5－二硝基水杨酸试剂：精确称取1g3，5－二硝基水杨酸1g，溶于20mL1mol/L NaOH溶液中，加入50mL蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水稀释至100mL。盖紧瓶塞，勿使CO2进入。若溶液混浊可过滤后使用； 试剂及配制 （3） 0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液： A液（0.1mol/L 柠檬酸）：称取C6H8O7.H2O 21.01g，用蒸馏水溶解并定容至1L； B液（0.1mol/L 柠檬酸钠）：称取Na3C6H5O7.2H2O 29.41g，用蒸馏水溶解并定容至1L。 取A液13.7mL与B液26.3mL混匀，即为0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液； （4）1％淀粉溶液：称取1g淀粉溶于100mL0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液中。 （5） 0.4M NaOH 实训步骤 1、称取1g萌发3天的小麦种子，置于研钵中。 2. 加入少量的石英砂和2mL的蒸馏水，研磨匀浆。 3. 将匀浆倒入离心管中，用6mL蒸馏水分次将残渣洗入离心管。提取液在室温下放置提取15至20分钟。每隔数分钟搅动一次，使其充分提取。 4. 然后在3000r/min速下离心10分钟。 5. 将上清液过滤，倒入100mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即制得α-淀粉酶原液。装入试剂瓶中，贴标签，保存于低温冰箱中，为以后的实验使用。 1、麦芽糖标注曲线的制作 取7支干净的具塞刻度试管，号，按表1加入试剂： 摇匀，置沸水浴中煮沸5min。取出后流水冷却，加馏水定容至20mL。以1号管作为空白调零点，在520nm波长下比色测定吸光度值。以麦芽糖含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线。 2、淀粉酶液的制备 称取1g萌发3天的小麦种子（芽长约1cm），置于研钵中，加入少量石英砂和2mL蒸馏水，研磨匀浆。将匀浆倒入离心管中，用6mL蒸馏水分次将残渣洗入离心管。提取液在室温下放置提取15～20m