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第三章 基因克隆的酶学基础 第一节 限制性内切酶 3.1.4 限制性内切酶的命名方式 3.1.5 同尾酶和同裂酶 3.1.6 Ⅱ型酶的特点和识别位点 3.1.7 类型II限制性内切酶的主要用途  3.1.8 影响核醚内切限制酶活性的因素 3.2.1 连接酶 3.2.2 常见的DNA连接酶 3.2.3 连接酶的连接作用 3.2.4 DNA的连接策略 第三节 DNA聚合酶 3.3.5 Taq DNA聚合酶 (一)酶活性与热稳定性 (二)离子依赖性 (三)忠实性 (四)抑制剂 ３.３.６　T7 DNA聚合酶 T7 DNA聚合酶有如下几个方面的用途： 修饰的 T7 DNA聚合酶 ３.３.７　末端转移酶 返回第三章 DNA聚合酶：需要模板，有多种活性，催化1个个核苷酸在链的3’接上去Taq DNA聚合酶 ： 来自于嗜热的古细菌逆转录酶：以mRNA为模板，在逆转录酶的作用下，合成一段与mRNA互补的 DNA片段末端核苷酸转移酶：需要模板 三种活性，即5’-3’的聚合酶活性、5’-3’的核酸外切酶活性和3’-5’的核酸外切酶活性。3’-5’的外切活性比T4或T7聚合酶的相应活性低得多。 3.3.1 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ(PolⅠ) 返回第三章 √ × √ √ √ √ 返回第三章 返回第三章 枯草杆菌蛋白酶水解大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ全酶所得 K1enow聚合酶仍具有5’-3’的聚合酶活性、 3’-5’的核酸外切酶活性,但失去了全酶的5’-3’的核酸外切酶活性。 在DNA分子克隆中，Klenow聚合酶的主要用途有： (1)修补经限制酶消化的DNA所形成的3’隐蔽末端 (2)标记DNA片段的末端 (3)cDNA克隆中的第二链cDNA的合成 (4)DNA序列测定。 3.3.2 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ K1enow片段 返回第三章 返回第三章 从T4噬菌体感染的大肠杆菌中纯化。 由噬菌体基因43编码的. 具有两种酶催活性，即5’-3’ 聚合活性、 3’-5’ 外切活性 可以用来标记DNA平末端或隐蔽的3’ 末端。 在没有核苷三磷酸存在的条 件下， 只具有3’-5’ 外切活性. 3.3.3 T4DNA聚合酶和取代合成法标记DNA 返回第三章 3.3.4 反转录酶 最普遍使用的是来源于鸟类骨髓母细胞瘤病毒(AMV)的反转录酶，由两条多肽链组成. 其中一条肽链具有反转录酶活性和RNaseH活性。RNaseH活性是一种核酸外切酶，它以5’-3’ 或 3’-5’的方向特异地降解RNA—DNA杂交分子中的RNA链。 另一条肽链则具有以RNA—DNA杂交分子为底物的5’一3’脱氧核酸外切酶活性 返回第三章 返回第三章 是从一种水生栖热菌分离提取的。嗜热真菌能在70～75℃生长。该菌是1969年从美国黄石国家森林公园火山温泉 中分离。 返回第三章 每个酶分子每秒钟可延伸约150bp，70℃ 60bp/秒，55℃ 24bp/秒。 过高(90℃以上) 或过低(22℃)都可影响酶的活性。 在90℃以上几乎无DNA合成， 但有良好的热稳定性。 在92.5℃、95℃ 、97.5℃时，PCR混合物中的Taq DNA聚合酶分别经130min，40min和5～6min后，仍可保持50%的活性。 Taq DNA聚合酶还具有逆转录活性。 返回第三章 Mg2+依赖性酶，非常敏感。 Mg2+能与dNTP结合而影响PCR反应液中游离 的Mg2+浓度，因而Mg2+的浓度在不同的反应体系中应适当调整。 一般反应 中Mg2+比dNTP总浓度高0.5～1.0mmol/L。 适当浓度的KCL能使Taq DNA聚合 酶的催化活性提高50～60%，其最适浓度为50mmol/L。 返回第三章 TaqDNA聚合酶具有5‘→3’聚合酶活性和5‘→3’外切酶活性，而无3‘→5’外切活 性 没有校正功能。 Taq DNA聚合酶的碱基错配机率为2.1×10-4. 返回第三章 低浓度的尿素、甲酰胺、二甲基甲酰胺(DMF)和二甲基亚砜(DMSD) 无影响 极低浓度的离子表面活性剂如脱氧胆胺酸钠(小于0.06%)，十二烷 基肌氨酸钠(小于0.02%)，十二烷基硫酸钠(SDS，小于0.01%)几乎可完全抑制该酶的 活性. 非离子表面活性剂在较高浓度(Tween20，NP-40.和Tritox-100)如5%时抑制酶活性. 低浓度的NP-40(0.05%)和Tween20(0.05%)能增强酶活性.低浓度SDS对酶的抑制作用可加入一定浓度的NP-40和Tween20抵消. TaqDNA聚合酶可在-20℃贮 存至少6个月。 返回第三章 由两种亚基组成：一种是T7噬菌体编码的基因5蛋白；另一种是大肠杆菌编码的硫氧还蛋白。 基因 5蛋白是一种非加工的DNA聚合酶，具有单链的3’、5’核酸外切酶活