基因工瘤程载体32.pptVIP

第二章 基因工程载体 1. 基因工程载体的概念 T vector的克隆过程 2. 基因工程对载体的要求 3. 载体的种类 第一节 质粒载体 （4）质粒的空间构型： ② 开环DNA（ open circular， ocDNA） （5）质粒空间构型与电泳速率 二、质粒的类型 1. 接合型质粒： 大肠杆菌接合（conjunction） 2. 非接合型质粒： （2）Col质粒： 三、质粒载体的构建 第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如pSC101, colE1, pCR, pBR313和pBR322。 第二阶段：增大载体容量(降低载体长度)，建立多克隆位点区和新的遗传标记基因,如pUC系列载体。 第三阶段：完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。 三、质粒载体的构建 用小写字母p代表质粒（plasmid），在p字母后用两个大写字母代表发现这一质粒的作者或实验室名称，再加上质粒编号。 如：pBR322：p表示一种质粒，而“BR”则是分别取自该质粒的两位主要构建者F. Bolivar和R. L. Rodriguez，322为编号。 三、质粒载体的构建 4. 质粒载体必须具备的基本条件 抗菌素选择原理 四、经典的大肠杆菌质粒载体 （4）克隆位点 2. pBR322： （5）pBR322的优点 3. pUC系列 （1）元件来源 pUC18/19 （4）选择标记 ② ?-半乳糖苷酶Xgal显色反应： ③ lacZ的?肽互补 2）受体菌lacZ突变（lacZ?M15） 3）载体lacZ’与?互补 4）?互补的插入失活 ④ IPTG的诱导作用 IPTG诱导的结果： （5）pUC系列载体的优点 2、噬菌体的生命周期 噬菌体的溶菌生命周期 噬菌体的溶原生命周期 一种典型的烈性噬菌体的生命周期 ?噬菌体和其DNA 2. ?噬菌体的基因组特点 3. ?DNA的复制 模型 （2）滚环复制 三、单链噬菌体载体 1. 单链DNA噬菌体的特点 2. M13 噬菌体 M13序列 （4）M13的生活周期 3. M13载体的构建： （2）加入酶切位点 M13mp18的多克隆位点 4. M13系列载体的优点 ?噬菌体感染细菌的早期：双链进行?型复制。 （1） ?型复制 感染的晚期：启动滚环复制机制。 形成多联体?DAN分子。 这种多联体分子必须在cos位点被切断成单体分子才能被包装起来。 M13、f1、fd 噬菌体 单链环状DNA的丝状大肠杆菌噬菌体： M13 噬菌体 （2）复制型（RF）是双链环状DNA。 （3）RF DNA和ssDNA都能转染感受态 大肠杆菌。并产生噬菌斑。 （5）可产生大量的含有外源DNA插入片 断的单链分子，便于作探针或测序。 （1）+DNA。（ssDNA） （4）不存在包装限制。 RF dsDNA在寄主细胞内以高拷贝形式存在。 成熟的噬菌体里只包装有 + DNA，也容易提取。 M13噬菌体只感染雄性大肠杆菌。 但M13 DNA可以转染雌性大肠杆菌。 6407 bp。 （2）DNA长度 （3）DNA提纯 （1）寄主 虽然不导致溶菌，但使菌斑混浊（细菌生长变慢，约为正常的1/2—3/4） M13通过雄性细菌的F性须注入其+DNA +DNA合成－DNA，形成RF dsDNA －DNA转录mRNA、合成+DNA、翻译形成噬菌体蛋白 组装成新的噬菌体M13，挤出寄主细胞 +DNA -DNA mRNA M13外壳蛋白 组装成子代M13 +DNA 注入大肠杆菌 复制 转录 翻译 +DNA 指导合成 +DNA 200个 RF DNA 每个细胞可以放出约1000个M13颗粒！ M13基因组中只有基因II与基因IV之间存在一段507bp的基因间隔区。 （1）克隆区域的选定 ① 基因间隔区（intergenic region, IG区） IG区内只有一个 BsuI 切点。 其余9个BsuI限制性位点分布在其它部位。 ② 酶切位点 M13 J. Messing证明，IG区存在M13的复制起点，但可以插入外源DNA而不影响M13噬菌体的活力。 在IG区内插入一个大肠杆菌的LacZ’（?-肽序列)。 利用?-肽序列中的三个单一酶切位点（Bgl II、Ava II 和 Pvu I）。 ① 在IG区内加入单一内切酶位点 第一个M13载体：M13mp1： ① 双抗菌素抗性选择标记 插入失活，分两次先后选择： 没有获得载体的寄主细胞? 在Amp或Tet中都死亡。 获得载体的寄主细胞? 在Amp或Tet其中之一中死亡。 外源基因?BamH I Amp中存活 但在Tet中死亡 外源基因?Ps