环介导等温扩增术原理.pptVIP

环介导等温扩增技术原理 等温扩增技术简介 等温扩增技术的应用前景 几种等温扩增技术比较 环介导的等温扩增技术原理 环介导的等温扩增演示 环介导的等温扩增检测 等温扩增技术(Isothermal Amplification Technology)是核酸体外扩增技术，其反应过程始终维持在恒定的温度下，通过添加不同活性的酶和各自特异性引物（或不加）来达到快速核酸扩增的目的。 与PCR技术相比核酸等温扩增对仪器的要求大大简化，反应时间大大缩短，更能满足快速简便的需求。 特异性高 分析速度快 成本低 突变率低 不需要升温降温过程，一台的加热器即可操作 检测核酸成分比检测微生物本身危险性小 方便诊断 环介导核酸等温扩增技术（LAMP） 滚环扩增技术 RCA 单引物等温扩增 SPIA 依赖解旋酶的等温扩增技术 HAD 链替代扩增 SDA 交叉引物扩增技术 CPA 核酸依赖性扩增检测技术 NASBA Qβ复制酶反应 温度 ℃ 引物 模板 其他 NASBA 42 需要2条 RNA 反转录酶，RNA酶H，T7RNA聚合酶 SPIA 42 1条 RNA 反转录酶，T7RNA聚合酶 HDA 37/65 需要2条 DNA 解旋酶，扩增片段小 SDA 37/65 不需要 DNA LAMP 63 4条 DNA DNA聚合酶 RCA 37-65 需要 DNA Qβ 37 不需要 RNA LAMP克服了传统PCR反应需要通过反复热变性获得单链模板的缺点，避免了反复升降温的过程，实现了恒温条件下的连续快速扩增，具有更高的灵敏度和扩增效率。 操作简单：只需一个水浴锅 快速高效：不需要预先的双链DNA热变性．避免了温度循环而造成?的时间损失 特异性强：针对靶序列6个区域设计的4种特异性引物。6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增。故其特异性极高。? 高灵敏度，对于病毒扩增模板可达几个拷贝，比PCR高出数量级的差异。 缺点：由于LAMP扩增是链置换合成，靶序列长度最好在300?bp以内。500?bp则较难扩增。故不能进行长链DNA的扩增。灵敏度高易造成假阳性结果。 环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification ,简称LAMP)是利用4个特殊设计的引物和具有链置换活性的Bst DNA聚合酶,在恒温条件下特异、高效、快速地扩增DNA的新技术。 LAMP技术以其特异性强、灵敏度高、快速、准确和操作简便等优点在核酸的科学研究、疾病的诊断和转基因食品检测等领域得到了日益广泛的应用。 60—65℃是双链DNA复性及延伸的中间温度，DNA在65℃左右处于动态平衡状态。利用引物合成的DNA链取代模板互补链。 ①扩增目的片段时依赖的是一种具有链置换特性的Bst DNA聚合酶 ②需四条能够识别靶序列六个特异区域的引物 ③LAMP法并不需要对双链DNA进行预变性及进行温度循环。? Bst DNA聚合酶大片段是Bacillus stearothermophilus DNA聚合酶的一部分，具有5→3DNA聚合酶活性 Bacillus stearothermophilus嗜热脂肪芽孢杆菌 针对靶基因的六个不同的区域，基于靶基因3’ 端的F3c、F2c和Flc区以及5’ 端的Bl、B2和B3区等6个不同的位点设计4种引物。 LAMP反应的开始阶段四条引物都被使用，但在循环阶段则只有内引物被使用。 FIP(Forward Inner Primer)：上游内部引物，由F2区和F1C区域组成，F2区与靶基因3’端的F2c区域互补，F1C区与靶基因5’端的Flc区域序列相同。 F3引物：上游外部引物(Forward Outer Primer)，由F3区组成，并与靶基因的F3c区域互补。 BIP引物：下游内部引物(Backward Inner Primer )，由B1C和B2区域组成，B2区与靶基因3’端的B2c区域互补，B1C域与靶基因5’端的Blc区域序列相同。 B3引物：下游外部引物(Backward Outer Primer )，由B3区域组成，和靶基因的B3c区域互补。 LAMP反应引物与对应模板区域 内引物FIP的F2与其模板的互补序列F2c结合，在Bst DNA聚合酶作用下，从F2的3’末端开始启动DNA合成，合成一条以FIP为新的DNA单链并与模板链结合形成新的双链DNA。 以F3为起始合成的新链与模板链形成双链。而原合成的以FIP为起始的DNA单链被置换而脱离产生一单链DNA，其在5’末端F1c和F1区发生自我碱基配对，形成茎环状结构。? 引物BIP的B2与模板链B2c区互补配对，合成以BIP为起始的新链，并与模板链互补形成DNA双链。同时，F端的环状结构将被打开，外引物B3与模板上B3c杂交后