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蛋白质等电点的测定 主要内容 (1)了解蛋白质的两性解离性质。 (2)学习测定蛋白质等电点的方法。 蛋白质的解离性质 蛋白质是两性电解质。在蛋白质溶液中存在下列平衡： 蛋白质的等电点 蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。当溶液的pH达到一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的pH值称为此种蛋白质的等电点。不同蛋白质各有其特异的等电点。在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，可利用此种性质的变化测定各种蛋白质的等电点。 最常用的方法是： ①测其溶解度最低时的溶液pH值。 ②等电聚焦电泳测其净电荷为零时的PH ③浊度、分光光度法 ④基于蛋白质与离子交换的作用 一、测定溶解度最低时的溶液PH 实验原理： 借观察在不同pH溶液中的溶解度以测定酪蛋白的等电点。用醋酸与酷酸钠(醋酸钠混合在酪蛋白溶液中)配制成各种不同pH值的缓冲液。向诸缓冲溶液中加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓冲液的pH值即为酪蛋白的等电点。 器材： 水浴锅、温度计、200毫升锥形瓶、100毫升容量瓶、吸管、试管、试管架、乳钵 试剂： (1)0.4％酪蛋白醋酸钠溶液 (2)1.00摩尔／升醋酸溶液 (3)0.10摩尔／升醋酸溶液 (4)0.01摩尔／升醋酸溶液 实验器材与试剂： 实验步骤： (1) 取同样规格的试营4支，按下表颠序分别精确地加入各试剂，然后混匀。 试管号 蒸馏水（ml） 0.01M醋酸（ml） 0.1M醋酸（ml） 1M醋酸（ml） 1 8.4 0.6 — — 2 8.7 — 0.3 — 3 8.0 — 1.0 — 4 7.4 — — 1.6 (2) 向以上试管中各加酪蛋白的醋酸钠溶液1毫升，加一管，摇句一管。此时1、2、3、4管的pH值依次为5.9、5.3、4.7、3.5。观察其混浊度。静置10分钟后，再观察其混浊度。最混浊的一管的pH即为酪蛋白的等电点。 二、等电聚焦电泳 原理：1）有一类两性电解质：它具有依次递变而又相差不大的等电点，在电场下形成递变而又连续的pH梯度，故在电泳介质中加入这种物质则能造成介质pH由酸到碱逐步变化。 2)各种蛋白质pI不同 3）两性电解质载体在电场作用下，按各自pI形成从阳极到阴极逐渐增加的连续而稳定的pH梯度 以聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持介质，并在凝胶中加入两性电解质载体，在电场作用下，蛋白质在此pH梯度的凝胶中泳动，当迁移至pH值等于pI处时，就不再泳动，而被浓缩成狭窄的区带。 三、实验试剂与仪器 1）两性电解质 2）30％丙烯酰胺溶液 3）TEMED 4）10％过硫酸铵溶液 5）负极缓冲液：0.1M NaOH 正极缓冲液：0.1M 磷酸或硫酸 固定液：10％（W/V）三氯乙酸 染色液 脱色液 蛋白质等电点标准 电泳仪 圆盘电泳槽 图 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图(A为正面,B为剖面) 四、操作方法 1. 凝胶柱的制备 （1）玻璃管的一端插在橡皮帽中 （2）配胶 表 10mL 7.5%凝胶的配制 试 剂 名 称 体积(mL) 凝胶贮液 2.5 两性电解质载体 0.5 蒸馏水 6.75 10%过硫酸铵 0.05 10%TEMED 0.1 蛋白质混合样品 0.1 混匀后置真空干燥器中抽气 10 min （3）将配好的凝胶溶液用细长头滴管加到预先准备好的玻管中，至离上端1 cm处，再用注射器缓缓加水3-5 mm高。 （4）待凝胶聚合 2. 电泳 将装有胶的玻管固定到电泳槽上槽的洞中（安装时要保证凝胶管垂直且橡胶塞孔密封不漏）在上槽中装入0.1mol/L氢氧化钠溶液，在下槽中加入0.1mol/L磷酸缓冲液。连接到电泳仪，接通电源，调电压至160 V，聚焦过夜，至电流降为0，则可关闭电源。 3．剥胶 电泳结束后，取下凝胶管，用蒸馏水洗净两端电极液，在凝胶条的正极端作上标记。用灌满水的注射器长针头插入凝胶与玻管管壁之间，边压水边慢慢转动玻管，推针前进，同时注入水，靠水流压力和润滑力将玻璃管内壁与凝胶分开，凝胶条即可流出。 4 .固定染色 取出凝胶条放在一块洁净的玻板上，用尺量出固定前的凝胶条长度。放入带盖试管中加入固定液。固定20min?2后，倒掉固定液后用脱色液漂洗2次，再染色1h，用蒸馏水漂洗数次后用脱色液脱色，直至蛋白质区