肝功能损伤实验 - 副本..pptVIP

肝功能损伤实验 目的 通过小鼠肝损伤模型的建立及肝损伤后血中转氨酶测定，熟悉赖氏比色法测定ALT的基本原理和ALT标准曲线的绘制，熟悉肝损伤指标变化的机制，了解赖氏比色法测定ALT的影响因素及其评价。 (一)肝损伤动物模型建立 【原理】 向小鼠腹腔注射CCl4，导致小鼠肝脏损伤，当肝细胞损伤后，细胞中转氨酶会外溢到血中，致血中相关酶活力显著增高。同时设一对照组(小鼠腹腔注射食用油)以作比较。 试剂 1．豆油。 2．2％CCl4溶液 以豆油为溶剂配制(V／V)。 操作步骤 1．动物准备 取小鼠若干只，体重约15～20g／只，室温饲养，水、食物可自由摄取。 2．小鼠肝损伤模型的建立 腹腔注射ccl4溶液0．2ml／只，24h后取血。 3．对照小鼠模型的建立 腹腔注射豆油0．2ml／只，24h后取血。 4．血样品采集方法 以镊子挤压小鼠眼眶近颞部，小鼠眼球即突出，用镊子夹住眼球向外摘出眼球，让血滴入小塑料离心管，收集血量约1ml左右，等血凝结后，离心取血清。 注意事项 1．摘除小鼠眼球采血，应让血滴自然滴入离心管，尽量不要将小鼠头在管口刮取，否则易致溶血。最好仅用一只眼球摘除放尽血，可减少血液损失。 2．离心时加速及减速不宜过快，离心速度为 3000r/min，10min 过快易致溶血。 (二)肝损伤相关酶指标测定1．ALT测定(赖氏比色法) 【原理】 L-丙氨酸+α-酮戊二酸 ALT 丙酮酸+L-谷氨酸 丙酮酸 + 2，4-二硝基苯肼 碱性条件下 丙酮酸-2，4-二硝基苯腙(红棕色，λ=505nm) a-酮戊二酸也能与2，4-二硝基苯肼生成相应的酮戊二酸一2，4-二硝基苯腙，但其在505nm等摩尔吸光度只有丙酮酸-2，4-二硝基苯腙的l／3左右，根据此点可测出丙酮酸量。与丙酮酸标准品配制成的系列标准液比较，求出样品中ALT活性 。 操作步骤 （1）ALT标准曲线绘制： a. 按下表向各管加入相应试剂 b. 混匀，放置10min，在波长505nm处，以蒸馏水调零，读取各管吸光度，各管吸光度均减“0”号管吸光度为该标准管的吸光度值。 c. 以吸光度值为纵坐标，对应的酶卡门活性单位为横坐标，各标准管代表的活性单位与吸光度值作图，即成标准曲线。 操作步骤 （2）标本的测定 ①在测定前取适量的底物溶液及中毒组和对照组血清，37℃水浴预温5min后使用；具体操作按下表进行。 ②混匀，室温放置10min，在波长505nm处以蒸馏水调零，读取各管吸光度。 结果计算 测定管吸光度减去样本对照管吸光度的差值为标本的吸光度。该值在标准曲线上查得ALT的卡门氏单位 参考范围5～25卡门单位。 注意事项 底物缓冲液中的α一酮戊二酸和显色剂2，4硝基苯肼均为呈色物质，吸样必须很准确。 每批试剂的空白管吸光度波动范围应在0.24-0.32之间，如超出此范围，应检查试剂及仪器等方面问题。 严重脂血、黄疸及溶血血清可增加测定的吸光度；糖尿病酮症酸中毒病人血中因含有大量酮体，能和2，4一二硝基苯肼作用呈色，也会引起测定管吸光度增加。因此，检测此类标本时，应作血清标本对照管。 注意事项 赖氏法考虑到底物浓度不足，酶作用产生的丙酮酸的量不能与酶活性成正比，故没有制定自身的单位定义，而是以实验数据套用速率法的卡门单位。赖氏法标准曲线所定的单位是用比色法的实验结果和卡门分光光度法实验结果作对比后求得的，以卡门单位报告结果，卡门法是早期的酶耦联速率测定法，卡门单位是分光光度单位。定义为血清1ml，反应液总体积3ml，反应温度25℃，波长340nm，比色杯光径1.0cm，每分钟吸光度下降0.001A为一个卡门单位（相当于0.48IU），赖氏比色法测定由于受底物α一酮戊二酸浓度的不足以及反应产物丙酮酸的反馈抑制等因素影响，标准曲线不能延长至200卡门单位。当血清标本酶活力超过150卡门单位时，应将血清用生理盐水稀释后重测。其结果乘以稀释倍数。 注意事项 加入2，4-二硝基苯肼溶液后，应充分混匀，使反应完全，加入NaOH溶液的方法和速度要一致，如液体混合不完全或NaOH溶液的加入速度不同均会导致吸光度读数的差异，呈色的深浅与NaOH的浓度也有关系，NaOH浓度越大呈色越深，NaOH溶液小于0.25mol/L时，吸光度下降变陡，因此NaOH浓度要准确。 方法学评价 ⑴重复性差 其原因有三：①由于α-酮戊二酸也能与2，4-二硝基苯肼反应生成相应的α-酮戊二酸苯腙因而限制其用量，如一般采用2.0mmol／L的浓度，反应速度只有最大反应速度的65％，使产物生成量与酶的活性之间不能呈现良好的线形关系 ②2，4一二硝