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第三节 氨基酸的测定 氨基酸分析 成人必需氨基酸共有８种：赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸。 如果饮食中经常缺少上述氨基酸，可影响健康。对婴儿来说，组氨酸也是必需氨基酸 。 原理 氨基酸分析仪的中心是离子交换层析柱，当流动相（缓冲溶液）推动氨基酸流经装有阳离子交换树脂的色谱柱时（日立835-50为磺酸型Na+柱），氨基酸与树脂中的交换基团进行离子交换，当用不同的PH值的缓冲溶液进行洗脱时，因交换能力不同而将氨基酸混合物分开。 洗脱的顺序为：酸性氨基酸和极性较大的氨基酸,其次是非极性的和芳香性氨基酸，最后是碱性氨基酸（赖氨酸、精氨酸、组氨酸）。相对分子质量小的比相对分子质量大的先下来，被洗脱的氨基酸用茚三酮显色，进行定量比色分析。 利用经硫化的阳离子交换柱,可分离二十多种氨基酸,将分离得到的氨基酸与水合茚三酮反应生成兰紫色化合物, ,在可见光范围(570nm和440nm)测定吸光度,从而完成检测和定量测定。 与氨基酸的标准溶液相比较,从而确定各种氨基酸的含量，根据与标样物比较相对保留时间和加入标样使峰增高法进行定性,采用内标和标准曲线法进行定量。 内标法: 内标法是将一定量的纯物质作为内标物,加入到准确称量的试样中,根据被测物和内标物的质量及在色谱图的峰面积或峰高的变化,就可以看出标准品和样品进样体积的差别。 内标物要满足以下要求： 1.试样中不含有该物质； 2.与被测组分性质比较接近； 3.不与试样发生化学反应； 4.出峰位置应位于被测组分附近，且无组分峰影响。 试样配制：准确称取一定量的试样W，加入一定量内标物 mS 外标法也称为标准曲线法: 外标法就是用标准品的峰面积或峰高与其对应的浓度作一条标准曲线,测出样品的峰面积或峰高,在标准曲线上查出其对应的浓度 特点及要求： 1. 外标法不使用校正因子，准确性较高， 2. 操作条件变化对结果准确性影响较大。 3.对进样量的准确性控制要求较高，适用于大批量试样的快速分析。 测定样品处理 除去脂肪等杂质后的待测样品，可直接上柱分析。若测定蛋白质样品的氨基酸组成，必须经酸水解把蛋白质完全变成游离氨基酸后才能上柱分析。蛋白质中的胱氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸和色氨酸在酸水解条件下不稳定，需采用另外的处理方法，即胱氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸首先在控制条件下用过甲酸氧化，使它们转变为对酸稳定的氧化物磺基丙氨酸和蛋氨酸砜，然后再用盐酸水解法从蛋白质中分离出来. 色氨酸则采用碱水解法从蛋白质中分离出来。 样品分析 把经处理后的样品上柱分析，上柱的样品量视自动分析仪的灵敏度而定。一般为每种氨基酸0.1nmol左右(水解样品干重约0.3mg)。 根据峰出现的时间来确定氨基酸的种类，从峰的高度和宽度可算出各种氨基酸的精确含量。 实验条件 实验仪器:HITACHI835-50型高速氨基酸自动分析仪 色谱条件:色谱柱:2.6mmID×150mm;柱温:53℃; 流速:0.225mL/min。 测定条件：必须在pH5～5.5，100℃下进行反应时间为10～15min，生成的紫色物质在570nm下进行比色测定。其生成的黄色化合物在440nm下进行比色测定。 样品中氨基酸的浓度 835-50型号氨基酸分析仪器的氨基酸适宜浓度为1-10nmol/50ml，脯氨酸6nmol／50ml。 缓冲液的pH与Na+浓度 溶液的pH值和钠离子浓度对氨基酸的分离有很大关系，配制不当会影响峰的位置，甚至会使个别氨基酸丢失，因此应特别精心配制。 柱温氨基酸的分离与柱温有关 835型氨基酸分析仪柱温规定53℃. 树脂的污染 污染的树脂也会使分辨率降低。微生物、蛋白质污染（游离氨基酸样品）、金属离子污染、油腻污染等。 除氨 在色谱柱前附加一除氨柱，除去缓冲液、试样或流路系统中混入的氨，防止氨在分离过程中被洗脱下来。因此，除氨柱可重复连续使用。 茚三酮的氧化 茚三酮很易氧化，氧化后显色效率降低，甚至变质失效。因此，除注意N2气保护外，茚三酮试剂不可过量配制和长期使用。 柱层析的阳离子交换树脂 是磺酸型强阳离子交换树脂（苯乙烯-二乙烯基苯）。 定量测定的依据 是氨基酸和茚三酮反应生成紫色化合物。而脯氨酸和羟脯氨酸则生成黄棕色化合物。 用离子交换柱层析测定的氨基酸图谱如图1-1，2所示 出峰的时间顺序： 天冬氨酸（Asp）、苏氨酸**（Thr）、丝氨酸（Ser）、谷氨酸（Glu） 甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、半胱氨酸（Cys）、色氨酸**（Trp）、缬氨酸**(Val) 蛋氨酸**（Met）、异亮氨酸**（Ile）、亮氨酸**（Leu）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸**（Phe） 赖氨酸**（Lys