细胞化学染等色-.ppt

临床血液学和血液学检验第四章 造血检验的基本方法 华中科技大学同济医学院 医学检验系 陈 万 新 第二节 细胞化学染色 细胞化学（或组织化学）是在细胞形态学的基础上运用无机化学、有机化学或生物化学等技术研究细胞在发育、增殖分化过程中的主要化学成分的定位、定量及代谢功能状态的学科，是细胞形态学的重要组成部分。 细胞化学染色一般包括固定、显示、复染等步骤。 主要用于： 显示细胞或组织的酶、蛋白质、糖类、脂类、无机盐（如铁）等化学成分的含量及分布状况； 研究细胞组织来源及分化程度；为疾病的诊断、鉴别诊断及治疗提供重要的依据。 中性粒细胞碱性磷酸酶染色（NAP） ㈠.原理： 方法一（偶氮偶联法）：在PH9.2~9.8的碱性溶液中，细胞中的碱性磷酸酶能将底物磷酸萘酚钠水解，生成a-萘酚和磷酸钠，再以稳定的重氮盐与萘酚偶联生成不溶性有色偶氮染料沉淀，定位于细胞浆中。 试剂： 1.固定剂：1∶9福尔马林乙醇液，即40％甲醛溶液（福尔马林）10ml加无水乙醇90ml混合即得。 2.a-磷酸萘酚钠溶液：100mg a-磷酸萘酚钠溶于100ml0.2mol/L（pH9.1～9.7）Tris缓冲溶液中，混匀后4℃保存。 3.Tris缓冲溶液（0.2 mol/L pH9.2）：Tris粉（三羟甲基氨基甲烷）2.43g溶于100ml蒸馏水中，加浓盐酸0.2ml（0.167ml）。 4.工作液配制（临用时现配）：取a-磷酸萘酚钠溶液1.5ml于试管内37oC水温箱中预热5分钟，加坚固篮BB盐1.5mg，混匀即可。 染色步骤： 1、干燥涂片（观察片及阳性对照片），滴加固定剂布满血膜固定5秒钟，流水冲洗，待干或滤纸吸干。 2、滴加作用液室温下（或37oC）染色15～20分钟，流水冲洗，待干。 3、中性红溶液复染3分钟，流水冲洗，干后鏡检。 结果判断： 阳性反应呈蓝黑色颗粒状，定位于细胞浆中。 计数方法： 按碱性磷酸酶活性强弱，分为5级 (0－IV或0－++++) 。 0级 0 胞浆呈原色，无颗粒。 Ⅰ级 + 胞浆呈浅灰色，阳性颗粒占胞浆的25%－50%。 Ⅱ级 ++ 阳性颗粒约占胞浆面积的50%－75%。 III级 +++ 阳性颗粒占胞浆面积的75%－100%。 Ⅳ级 ++++ 胞浆充满蓝黑色致密的阳性颗粒，占胞浆面积的l00%，甚至遮盖胞核。 每例的血片，均计数100个中性粒细胞（杆状核及分叶核粒细胞），求出NAP阳性细胞的百分比(阳性率)，并按酶活性的强弱不同，求得阳性指数(积分)。 0级 0 胞浆呈原色，无颗粒。 Ⅰ级 + 胞浆呈浅灰色，细小蓝黑色颗粒占胞浆面积的25%～50%。 Ⅰ级 + 胞浆呈浅灰色，细小蓝黑色颗粒占胞浆面积的25%～50%。 Ⅱ级 ++ 胞浆呈棕色片状沉淀，小到中等颗粒约占胞浆面积的50%～75%。 Ⅱ级 ++ 胞浆呈棕色片状沉淀，小到中等颗粒约占胞浆面积的50%－75%。 Ⅲ级 +++ 胞浆充满棕黑色沉淀，分布均匀，中到大颗粒占胞浆面积的75%－100%。 Ⅲ级 +++ 胞浆充满棕黑色沉淀，分布均匀，中到大颗粒占胞浆面积的75%－100%。 Ⅳ级 ++++ 胞浆充满深黑色致密的团块状沉淀，甚至遮盖胞核，中到大颗粒占胞浆面积的l00%。 注意事项： 1.??? 重氮盐以坚固篮BB盐为最佳，其次为坚固篮B盐及坚固篮RR盐。 2.??? 也可用新鲜配制的六偶氮副品红为重氮盐，配方为：10ml a-磷酸萘酚钠溶液中加六偶氮副品红50μl，其NAP阳性反应呈红色颗粒状。六偶氮副品红：4%副品红（2N盐酸）溶液与4%亚硝酸钠溶液1∶1混合，静置1min。 3.??? 重氮盐应适量，过量会导致染色失败，出现假阴性；量不足，则阳性反应较弱。 4.??? 工作液配好后应立即使用（5min以内）。 需用感染发热病人或正常人外周血涂片作为阳性对照。 ㈡.正常分布： 阳性反应主要见于成熟中性粒细胞（杆状及分叶粒细胞）中，反应结果以阳性率和积分值报告。 正常参考值：成人NAP阳性率28.7％（20%－40%），积分32.1（20－80）。 ㈢.临床意义： ⒈类白血病反应与慢性粒细胞白血病的鉴别诊断：前者显著增高，阳性率常达90%以上，积分常高于200分；后者显著减低，积分可为0。 ⒉细菌性化脓性感染时，积分显著增高；病毒性感染时多为正常或稍低。 ⒊淋巴细胞白血病时常增高；单核细胞白血病时正常或增高；慢性中性粒细胞白血病时增高，其它各型粒细胞白血病时减低；白血病伴感染时增高。 ⒋真性红细胞增多症、骨髓纤维化、再生障碍性贫血时增高，PNH时常减低。 5.某些肿瘤的鉴别诊断，如骨肿瘤、消化道肿瘤的肿瘤细胞碱性磷酸酶常为较强阳性反应。 酸性磷酸酶染色（