医学分子身生物学-基因组.pptVIP

遗传信息在染色体上，但染色体不能直接用来测序，必须将基因组这一巨大的研究对象进行分解，使之成为较易操作的小的结构区域，这个过程就是基因作图。 根据使用的标志和手段不同，有4种作图类型：遗传图谱、物理图谱、序列图谱、基因图谱。 基因组作图 1、遗传图谱(genetic map) /连锁图谱(linkage map) 指基因或DNA标志在染色体上的相对位置与遗传距离。它以具有多态性的遗传标记为“路标”，以重组频率为图距的基因组图。 遗传图谱的建立为基因识别和完成基因定位创造了条件。 遗传多态性：在一个遗传位点上具有一个以上的等位基因，在群体中的出现频率皆高于1% 遗传标记：等位基因、RFLP、MS、SNP等 遗传距离：在减数分裂事件中两个位点之间进行交换、重组的百分率，1%的重组率称为1“厘摩(centi-Morgan，cM) ” 限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphisms, RFLPs）：用一种或几种限制性内切酶切割基因组DNA，用探针杂交并放射自显影。由于DNA酶切位点的变异所造成的“能切”与“不能切”两种状况，可产生不同长度的片段(等位片段),可用凝胶电泳显示多态性。 数量可变串联重复(VNTR) /小卫星 短串联重复(STR)/微卫星(MS):使遗传图的精度提高;可作为物理图谱的标志，促进了遗传图谱与物理图谱的整合。 单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms， SNPs) 不同个体间在基因水平上的单核苷酸变异。平均每500～1000bp出现一个碱基差异,如果一个碱基位置发生的变异在1%以上的人群中存在，这个位点就被定义为SNP位点。位于编码区的SNP称为cSNP。2个无关个体间有300万SNPs. 单核苷酸多态标记（SNP） 2、物理图谱 指DNA序列上各遗传标志间的实际距离，是把遗传图谱中克隆群上的DNA片段按实际的物理位置进行排序所构建的图谱。距离单位为bp/kb/Mb。 物理图谱反映的是DNA序列上两点之间的实际距离，而遗传图谱则反映这两点之间的连锁关系。 在DNA交换频繁的区域，两个物理位置相距很近的基因或DNA片段可能具有较大的遗传距离，反之亦然。 染色体显带技术： 通过各种染色法，以染色体上显示的深浅不同的带型确定DNA序列分布和位置，可区分107bp范围。 细胞遗传学图:用于对以104kb为长度量级的区域制图 FISH（荧光原位杂交)技术 荧光原位杂交图（fluorescent in situ hybridization map，FISH map） ：用不同波长荧光标记的各种DNA序列（探针），与染色体上的互补序列杂交而不破坏染色体的整体形态，显微镜下观察、辨认荧光标记在染色体上的定位并绘制图谱。 限制性图谱(restriction map): 用于对小区域,如kb量级做精细结构制图 限制性酶切图：选用合适的限制性核酸内切酶对基因组DNA或部分基因组DNA进行酶切，获得以酶切位点为标记的物理图。 辐射杂交图： 对片段DNA的断点作图。 辐射杂交细胞图（radiation hybrid map，RH）：利用X射线照射人细胞，使染色体随机断裂，然后与啮齿动物细胞杂交克隆，人的染色体片段便被整合到啮齿动物染色体上。两个相邻基因或DNA标志的距离越近，越可能出现在同一片段，进入同一杂交细胞。通过识别、定位技术和统计学分析，可计算人DNA标志的连锁关系及其在染色体上的排列。 Huds on TJ等构建的相隔 199kb含有15086个STS图谱标志着人类基因组计划的物理图谱已初步完成。 序列标签位点(sequence tagged sites, STSs): 在染色体上定位明确，而且可用PCR扩增的单拷贝序列，通常为200-500bp。 3、序列图谱 以某一染色体上所含的全部碱基顺序绘制的图谱。既包括可转录序列，也包括非转录序列，是转录序列、调节序列和功能未知序列的总和。 连续克隆系逐个克隆法 （公共领域测序计划） （1）建立插入人类基因组片段的酵母人工染色体（YAC）克隆群。 （2）利用高频分布、易于检索的DNA标志或者DNA指纹图谱建立克隆之间的联系，组成有序排列的连续克隆系，最常使用的DNA标志有STS和表达的序列标签（expressed sequence tag，EST）。 （3）将克隆群定位于染色体的不同区域，构成完全基因组物理图谱。 （4）进行次级克隆，序列分析。 ①用机械方法打断DNA，建立插入片段约2kb的高度随机基因组文库。 ②高效、大规模的两末端测序。 ③用有关软件对测序克隆片段进行序列集合。 ④用适当方法填补缺口。 全基因组鸟枪法（美国C